内脏异位综合征患儿中DNAI1和DNAH5基因编码区突变分析

目的 筛查中国汉族内脏异位综合征患儿DNAI1和DNAH5基因编码区突变情况。方法 临床招募确诊内脏异位综合征患儿及健康体检儿童,提取外周血DNA行全外显子组测序,检测DNAI1及DNAH5基因编码区核苷酸变异;Sanger测序验证外显子测序发现的突变位点;以生物信息学软件Mutationtaster、SIFT、PolyPhen-2分析位点变异对蛋白功能的影响。结果 81例内脏异位综合征患儿及89例健康儿童的外显子测序结果可用于后续分析。在81例内脏异位综合征患儿中发现存在3个DNAI1及3个DNAH5基因的编码区突变位点,4例(4.94%)患儿携带DNAI1基因突变,2例(2.50%)患儿携带DNAH5基因突变;突变位点在89例健康儿童中均未发现。生物信息学分析提示上述突变位点可能破坏蛋白质功能。结论 中国汉族内脏异位综合征患儿DNAI1和DNAH5基因突变发生率分别为4.94%和2.50%,DNAI1和DNAH5基因突变可能与中国汉族儿童内脏异位发生相关。

dna Y基因产物提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的表达

对提高人尿激酶原ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的表达水平进行了研究。通过ＰＣＲ方法在其结构基因５端添加起密码子ＡＴＧ，用人工合成的不依赖于ρ因子的终止序列替换３端非翻译区，得到完整的人尿激酶原结构基因。将其克隆在表达质粒ｐＫＫ２３３－２中，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＪＡ２２１，人尿激酶原得到初步表达。但表达水平很低，原因可能是人尿激酶原ｃＤＮＡ富含真核细胞偏爱的密码子，而大肠杆菌中识别这些密码子的ｔＲＮＡ是稀有ｔＲＮＡ。通过相容性质粒ｐＵＢＳ５２０引进ｄｎａＹ基因，增加大肠杆菌中ｔＲＮＡＡｒｇＡＧＡ／ＡＧＧ的含量，以改善大肠杆菌对人尿激酶原ｃＤＮＡ中稀有Ａｒｇ密码子的识别，人尿激酶原的表达水平提高约５倍。

人尿激酶原在大肠杆菌中表达的研究

用限制性内切酶将人尿激酶原cDNA酶切成一系列基因片段 ,并分别在大肠杆菌中表达。发现其中 1个富含大肠杆菌稀有密码子AGG(精氨酸 )的片段表达量低 ,成为人尿激酶原cD NA在E .coli中高效表达的限制因素。将富含AGG(精氨酸 )的片段在E .coliBL2 1 CodonPlusTM RIL中表达 ,通过该菌株引入dnaY基因 (即tRNAagg/aga(Arg) )使该片段的表达量提高了 10倍。最后用同样的方法提高全长人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的表达量 ,使其表达量达到全菌蛋白的5%。