DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的:克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法:从人胎脑组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增DOC-1的CDS序列,再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化E.coliBL21,用IPTG诱导表达,GlutathioneSepharose4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致,测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带,经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论:成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体,表达并纯化出GST-p12重组蛋白,为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。

两种人源性doc1基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的:构建p12蛋白真核表达重组载体,为基因治疗口腔癌提供基础研究。方法:反转录-聚合酶链式反应克隆出doc1基因ORF读框,两端连入酶切位点,导入真核表达载体pT7-FLAG-4及pEGFP-N1。结果:重组子pT7-FLAG-4-doc1及pEGFP-N1-doc1经限制性酶切分析,PCR鉴定和序列测定为正确重组质粒。结论:成功构建p12蛋白真核表达重组质粒pT7-FLAG-4-doc1及pEGFP-N1-doc1,为今后瞬时和稳定转染细胞提供基础。