带状疱疹后遗神经痛的脊髓发病机制的研究进展

带状疱疹后遗神经痛(PHN)是急性带状疱疹(HZ)痊愈后,遗留下来的一种病理性疼痛综合征。目前,虽然针对PHN在外周敏化和中枢处理等方面的研究有一定进展,但由于其发病机制复杂,临床治疗效果不佳,为患者带来极大困扰。水痘-带状疱疹病毒(VZV)是PHN的病原体,VZV在背根神经节的潜伏和激活与其蛋白表达相关。脊髓背角的结构与功能变化是致使中枢敏化的直接原因。脊髓及脊髓上结构参与痛觉的传递和加工过程,对疼痛信息产生适度的易化或抑制。近年来,针对脊髓胶质细胞参与PHN的研究日趋增多,为PHN的临床治疗特别是脊髓干预提供了理论依据。

低频电疗对周围神经损伤后白鼠的脊髓后角神经细胞活动电位的影响

目的:应用周围神经损伤的动物模型,探讨低频电疗对被机械性刺激和温度刺激所引发的脊髓后角神经细胞活动电位(膜电位)的影响。方法:用Sprague-Dawley雄性白鼠,制作出周围神经损伤疼痛模型作为实验组。用行动学和电生理学方法测定后腿的躲避反应和脊髓后角神经细胞的膜电位,并与对照组进行比较。结果:①实验组被机械性刺激和温度刺激所引发的躲避反应频率明显高于对照组(P<0.01)。②实验组被机械性刺激和温度刺激所引发的脊髓后角神经细胞膜电位明显高于对照组(P<0.01)。③实验组经低频电刺激10min后,其脊髓后角神经细胞的膜电位明显低于低频电刺激前脊髓后角神经细胞的膜电位(P<0.01)。④在实验组低频电刺激的同时静脉注射纳络酮10min后,其脊髓后角神经细胞的膜电位明显高于未注射纳络酮组(P<0.01)。结论:低频电缓解周围神经损伤所致疼痛的作用机理可能与其促进分泌内啡呔等中枢鸦片样物质,作用于脊髓后角神经细胞,降低其活性有关。

糖尿病神经病理性痛大鼠脊髓背角凋亡细胞与凋亡蛋白酶caspase-3的表达变化

目的探讨糖尿病神经病理性痛(DNP)大鼠脊髓背角凋亡细胞及与之相联系的凋亡蛋白酶caspase-3的表达变化。方法健康雄性SD大鼠60只,随机分为DNP组和正常对照组,每组30例。DNP组:腹腔注射链脲霉素(STZ)50 mg/kg制备成DNP模型;正常对照组给予等容量0.9%氯化钠溶液。分别给予注射STZ或0.9%氯化钠溶液后3、5、7周时取10只大鼠,采集静脉血样,测定空腹血糖浓度,然后测定机械缩足阈值,取2组大鼠L1-5脊髓组织,采用原位末端标记法(TUNEL)检测2组大鼠脊髓背角神经细胞凋亡的变化,采用免疫组织化学染色法观察凋亡蛋白酶caspase-3的表达变化。结果与正常对照组比较,DNP组血糖升高,机械缩足阈值降低(P<0.05),凋亡细胞与凋亡蛋白酶caspase-3的表达逐渐增加(P<0.05)。结论 DNP大鼠脊髓背角凋亡细胞与凋亡蛋白酶caspase-3的表达上调。

嗅鞘细胞对脊髓后角神经元突起生长的影响

目的:观察嗅鞘细胞对胚胎脊髓后角神经元突起生长的影响。方法:分离孕15d胚胎大鼠脊髓,取纵向分开的后半制备成细胞悬液,培养于:(1)原代培养的嗅鞘细胞单细胞层上;(2)嗅鞘细胞培养上清中;(3)原代培养的成纤维细胞单细胞层上;(4)单纯培养。24h后终止培养,行抗神经丝-200免疫细胞化学染色。每组随机取15个神经元,在LeicaQ-570图像分析仪中测量各组神经元的平均总突起长度及平均单个最长突起长度,进行组间比较。结果:神经元平均总突起长度(1)～(4)组分别为408.62±126.91滋m、336.24±106.34滋m、199.37±76.14滋m和64.61±24.49滋m;平均单个最长突起长度(1)～(4)组分别为180.13±83.54滋m、141.22±53.68滋m、107.29±43.35滋m和23.04±5.30滋m。第(1)、(2)组神经元平均总突起长度和平均单个最长突起长度明显高于第(3)、(4)组(P<0.01),而(1)、(2)组之间没有明显差异(P>0.05)。结论:与嗅鞘细胞共培养能明显促进胚胎脊髓后角神经元突起的生长速度。

备用根大鼠脊髓后角提取液中神经营养活性组分的分离及生物活性测定

制作备用根大鼠脊髓后角提取液，取其分子量大于10kD的组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现手术侧和非手术侧的电泳区带数目大致相同，但手术侧样品的第四条蛋白质区带扫描的吸收峰面积百分比大于非手术侧样品的第四条区带，两者在量上可能有差别。将手术侧样品经交联葡聚精G-75凝胶层析，得到两个洗脱峰．第一峰洗脱液有促进体外培养的背根节神经元存活及其突起生长的作用，其电泳分析显示4条主带，分子量在40～80kD之间．实验结果提示部分去传入纤维支配的脊髓后角组织含有神经营养活性物质，该物质的分子量约在40～78kD之间．

用细胞钓蛋白带技术初探脊髓源性神经营养活性物质

用5只单侧后肢备用根猫术后5d的两侧脊髓背角组织提取液进行聚丙烯酰肢凝胶电泳，再以鸡胚背根节种经细胞构蛋白带技术找寻有神经营养活性的蛋白带．结果显示：手术侧组的电泳凝胶条上相对迁移享0．10～0．13和0．43～0．50两处均有较多的神经细胞附着，细胞数分别是165个2.5×105μm2、216个／2．5×105μm2．非手术侧组凝胶条相应两处同一面积内仅有1或2个细胞．两侧相比有显著性差异（P＜0001），提示手术侧组电泳凝胶条相对迁移率0．10～013与043～0．50两处含有能维持种经元存活的神经营养活性物质．

5-羟色胺增强甘氨酸激活的大鼠脊髓背角浅层神经元的全细胞电流

应用制霉菌素穿孔膜片钳全细胞记录技术研究了5－HT对急性分离的大鼠脊髓背角浅层（Ⅰ、Ⅱ层）神经元甘氨酸激活的全细胞电流的调控作用。实验结果表明：（1）在脊髓背角浅层神经元，甘氨酸作用于士的宁敏感型的甘氨酸受体，在钳制电位为-40mV时，可引起内向电流（IGly）；（2）5－HT呈浓度依赖性的增强Gly反应；（3）5－HT的增强作用既不改变IGly的平衡电位，也不影响Gly与受体的亲和力；（4）5－HT2受体激动剂α-甲基-5－HT能模拟5－HT的增强效应；而5－HT2受体的拮抗剂ketanserine可阻断5－HT对IGly的增强作用；（5）蛋白激酶C（PKC）的抑制剂chelerythrine可抑制5－HT对IGly的增强作用。本研究的结果说明：5－HT可呈浓度依赖性地增强大鼠脊髓背角浅层神经元的IGly，5－HT经5－HT2受体介导其对IGly的调控，脊髓背角浅层神经元内经PKC的信号转导途径在5－HT对IGly的增强效应中起重要的作用。本研究的结果提示5－HT和Gly的相互作用在脊髓水平的伤害性信息传递和调控过程中可能具有重要的意义。

鸡脊髓后角Ⅰ、Ⅱ层内大神经元的免疫细胞化学研究

本研究采用心脏灌流法固定鸡标本 ,切取鸡脊髓颈膨大部分 ,利用免疫细胞化学法 ( PAP法 ) ,在光镜下观察了后角大神经元 ,其周围有大量 SP样免疫反应终扣。大神经元的胞体主要分布在 层、 层外侧区和 层内 ;树突伸向 层、 层外侧区以及 层的深部。电镜下观察 ,在 层内 ,大神经元的树突与突触小球的 P物质阳性中心终末形成突触。这一发现提示 ,大神经元直接接受来自初级感觉传入终末的信息。结合以前的研究推测

5-HT受体亚型在原代培养大鼠脊髓背角神经元的表达

为探讨脊髓背角内 5 -HT发挥作用的受体类型及其胞内信号转导机制 ,本研究首先利用免疫荧光技术对胎鼠脊髓背角神经元的产率进行了观察 ,再利用反转录 PCR方法观察了 5 -HT受体 14种亚型 m RNAs在原代培养神经元中的表达。原代培养的背角神经元生长状态良好 ,存活时间达到 14～ 2 1d。对培养的背角细胞用神经元特异性标志物—神经细胞核蛋白 (Neu N)进行免疫荧光检测的结果表明 ,神经元的产率超过 90 % ;用 PCR方法在培养的背角神经元中检测到了 5 -HT1 A、5 -HT1 B、5 -HT1 D、5 -HT1 F、5 -HT2 A、5 -HT2 C、5 -HT3、5 -HT4 、5 -HT5A、5 -HT5B、5 -HT6 和 5 -HT7等受体亚型 m RNAs的表达。但上述各受体亚型的表达水平存在差异 ,未检测到 5 -HT1 E和 5 -HT2 B受体亚型 m RNAs的表达。结果表明 ,本研究建立的实验方法可满意地获得原代培养脊髓背角神经元 ;这些神经元不但表达多种受体亚型 ,而且表达类型与以往在成年大鼠脊髓背角观察到的表达状况基本一致。上述结果为进一步开展 5 -HT作用机制的体外研究奠定了基础。

刺激延髓背角诱发的小鼠脑干网状结构内向Vmo投射的GABA能神经元突触后反应的电生理学研究

本实验利用谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠制备离体脑片,结合TMR逆行束路追踪技术,在荧光镜和红外镜头下,利用膜片钳全细胞记录的方法对电刺激延髓背角(即三叉神经脊束核尾侧亚核,Vc)诱发的小鼠小细胞网状结构(PCRt)内GABA能和TMR逆标的运动前神经元的突触后反应及其反应类型、药理学特征进行系统的研究。结果显示:(1)高频刺激(20 Hz)Vc,在PCRt内GFP和TMR双标的运动前神经元上可记录到兴奋性的突触后电流(EP-SCs),波形显示为单突触反应;(2)电压钳记录模式下,α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体(AMPA受体)拮抗剂氨基-2-硝基喹啉-2,3-二酮(CNQX)及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)阻断剂D,L-2-氨基-5-磷酸基戊酸(AP-5)均可显著降低刺激Vc所诱发的小鼠PCRt内GFP和TMR双标神经元的EPCSs的幅值;(3)电流钳模式下,刺激Vc,在PCRt内GFP和TMR双标的神经元上记录到兴奋性突触后电位,其幅度与刺激强度在一定范围内呈正相关。以上结果提示,小鼠PCRt内向三叉神经运动核(Vmo)发出投射的GABA能运动前神经元可通过其细胞膜上AMPA受体或NMDA受体的介导,对口面部伤害性信息发挥整合和调控作用,以实现对口面部伤害性反射活动的精确调节。

丹参酮IIA对神经性痛大鼠脊髓背角Bcl-2和Bax表达的影响

目的:探讨丹参酮IIA的镇痛机制,研究其对慢性神经病理性痛大鼠脊髓背角内Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达的影响。方法:45只SD大鼠被分为假手术组和模型组,假手术组仅暴露实验大鼠右侧坐骨神经干不予结扎,模型组结扎实验大鼠右侧坐骨神经干,生理盐水组是在模型组大鼠鞘内注射生理盐水,处理组是在模型组大鼠鞘内注射丹参酮IIA,检测各组大鼠机械痛阈和热痛阈,采用免疫荧光组织化学检测各组大鼠脊髓背角内Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白和Bax蛋白的表达。结果:假手术组大鼠的热痛阈和机械痛阈较高,脊髓背角内仅有少量的Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达;与之比较生理盐水组大鼠的热痛阈和机械痛阈降低,Bcl-2蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表达增多,Bcl-2/Bax比值减小,说明大鼠模型制备成功可以进行后续实验;与生理盐水组比较,处理组脊髓背角内Bcl-2蛋白的表达增多,但Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表达下降,Bcl-2/Bax比值增大,处理组热痛阈和机械痛阈升高。结论:该研究中丹参酮IIA的镇痛作用可能与脊髓背角内Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白的增多以及Bax蛋白的降低有关。

独一味对糖尿病痛大鼠脊髓背角内胶质细胞激活的影响

目的考察独一味对糖尿病痛大鼠脊髓背角内胶质细胞激活的影响。方法 70只大鼠随机分成正常组、枸橼酸-独一味组、链脲佐菌素-安慰剂组、链脲佐菌素-独一味组(30、224、300、3 000 mg/kg),每组10只。链脲佐菌素枸橼酸缓冲液建立糖尿病痛大鼠模型,机械痛刺激法测定大鼠后足爪痛阈,免疫荧光染色、Western blot法检测大鼠脊髓背角内Iba-1、GFAP、p-STAT3表达水平。结果与链脲佐菌素-安慰剂组比较,链脲佐菌素-独一味组(30、300、3 000 mg/kg)痛阈有所增加,并呈明显的剂量依赖性(P <0. 05),在300、3 000 mg/kg剂量下更显著(P <0. 01);链脲佐菌素-独一味组(224 mg/kg) Iba-1、GFAP阳性细胞数显著减少(P <0. 01),蛋白表达显著降低(P <0. 01),p-STAT3表达水平也显著降低(P <0. 01)。结论独一味可有效缓解糖尿病痛大鼠疼痛反应,其机制可能与抑制大鼠脊髓背角内胶质细胞激活、降低p-STAT3表达、改善炎症有关。

P2Y受体激动剂2-mesADP诱发脊髓背角小胶质细胞[Ca^(2+)]i升高

目的观察体外培养的背角小胶质细胞P2Y受体激活对其[Ca2+]i的影响。方法培养并纯化脊髓背角小胶质细胞,采用激光共聚焦技术观察P2Y受体激活后小胶质细胞[Ca2+]i的变化。结果 P2Y受体激动剂2-mesADP在10μm即可引起小胶质细胞[Ca2+]i升高,当随着2-mesADP浓度增大,小胶质细胞[Ca2+]i升高更为明显。结论体外培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞P2Y受体激活可以促进细胞[Ca2+]i升高。

坐骨神经脉冲射频对慢性坐骨神经压迫损伤模型大鼠脊髓背角胶质细胞活化水平的影响及其镇痛作用

目的:观察坐骨神经结扎处脉冲射频(PRF)对慢性坐骨神经压迫损伤(CCI)模型大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞活化水平的影响,探讨坐骨神经PRF镇痛机制与脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞活化水平的关系。方法:雄性SPF级SD大鼠40只随机分为CCI假造模PRF假治疗组(SS组)、CCI假造模PRF治疗组(SP组)、CCI造模PRF假治疗组(CS组)和CCI造模PRF治疗组(CP组),每组10只。CCI造模成功后4d行PRF治疗,在坐骨神经结扎处行标准PRF (120s、42℃)。于CCI造模前1d (D0)及造模后1、3、5和7d (D1、D3、D5和D7)测定大鼠患侧机械缩足反射阈(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)。疼痛行为学测试完成后(D7)取患侧L3～5脊髓背角,Western blotting法检测脊髓背角小胶质细胞特异性蛋白(Iba-1)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的蛋白表达水平。结果:与SS组比较,CCI造模后不同时间点CS组大鼠患侧出现足外翻、跛行、脚趾弯曲聚拢和行走时抬足等行为学表现,MWT和TWL均明显下降(P<0.01),脊髓背角Iba-1和GFAP蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与CS组比较,CP组大鼠(D5和D7)PRF后足外翻、跛行、脚趾弯曲聚拢和行走时抬足等行为学变化明显缓解,MWT和TWL值明显升高(P<0.01),脊髓背角Iba-1蛋白表达水平明显下调(P<0.05),GFAP蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:坐骨神经PRF能有效缓解CCI模型大鼠的神经病理性疼痛(NP),坐骨神经PRF可抑制脊髓背角小胶质细胞活化水平,其镇痛机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞活化有关。

大鼠脊髓背角胶状质神经元去极化反跳参与大鼠慢性神经病理性疼痛

目的:探索脊髓背角胶状质(substantia gelatinosa,SG)神经元去极化反跳的电生理特性,进一步阐明疼痛的脊髓调控机理,为慢性疼痛疾病的治疗药物研发提供科学依据。方法:取4周龄雄性SD大鼠66只,随机分为3组(n=22):模型组(坐骨神经部分结扎,PSNL)、假手术组(sham)和对照组(control)。测量三组大鼠机械痛阈,膜片钳记录去极化反跳等电生理特性,进行对比分析。结果:(1)模型组术后7~14d机械痛阈明显低于另外两组(P<0.05);(2)每组SG神经元均有50%以上出现去极化反跳现象,而且模型组去极化反跳出现的概率明显高于另外两组(P<0.05);(3)模型组SG神经元的动作电位阈值明显低于其他两组,输入阻抗和动作电位频率均高于另外两组(P<0.05)。结论:大鼠坐骨神经部分结扎术后去极化反跳现象增加,神经元兴奋性增高,出现机械痛敏,提示SG神经元去极化反跳可能参与慢性疼痛的调控。

前列腺酸性磷酸酶可能通过突触前机制参与骨癌痛大鼠脊髓镇痛

目的:运用神经电生理学方法,观察前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)对骨癌痛(cancer-induced bone pain,CIBP)大鼠脊髓背角神经元兴奋性的影响。方法:SD雌性大鼠12只,随机分为两组(n=6):CIBP模型组和假手术组,CIBP组于右侧胫骨骨髓腔内接种5μl大鼠乳腺癌细胞(2×105个),14天后造模完成。运用腰髓薄片全细胞膜片钳记录两组大鼠脊髓背角神经元兴奋性的变化,在灌流液中加入PAP,观察PAP对两组大鼠脊髓背角神经元兴奋性的影响。结果:脊髓薄片全细胞电压钳研究表明,与假手术组大鼠对比,骨癌痛大鼠脊髓背角Ⅱ层神经元自发的兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory post-synaptic currents,sEPSCs)和刺激电极诱发的兴奋性突触后电流(evoked excitatory post-synaptic currents,eEPSCs)的幅度显著增大,而sEPSCs的频率未见变化。给予PAP灌流,PAP显著降低骨癌痛大鼠脊髓背角Ⅱ层神经元的sEPSCs发放频率,而对其幅度未见明显影响;且该效应可被腺苷A1R的拮抗剂CPX翻转。PAP对于假手术组大鼠脊髓背角神经元兴奋性没有明显影响。结论:PAP可能通过突触前机制参与骨癌痛模型大鼠的脊髓镇痛过程。

脊髓胶质细胞参与慢性内脏痛发病机制研究

慢性内脏痛(chronic visceral pain,CVP)是由人体内脏器官基础疾病引发的多种疾病的常见症状之一。其原因包括血管机制、机械因素、持续炎症和不明原因的功能机制。虽然其发病机制尚不明确,但近年来越来越多的研究已开始从神经元转向胶质细胞。脊髓胶质细胞,尤其是星形胶质细胞和小胶质细胞在CVP中起重要作用。基于此,本研究对二者在CVP中的作用机制进行阐述,包括细胞因子、趋化因子和神经活性物质的释放以及细胞内信号通路的改变。最后,由于CVP可发生在多种疾病中,针对星形胶质细胞和小胶质细胞为药用靶点治疗疾病有广阔的应用前景。

脊髓背角卡配因在大鼠足底炎性痛形成中的作用

目的探讨脊髓背角卡配因在大鼠足底炎性痛形成中的作用。方法雄性SD大鼠48只，6周龄，体重160—200g，采用随机数字表法，将其随机分为3组：正常对照组（C组，n=8）、PBS组（n=16）和酵母多糖诱发足底炎性痛组（Z组，n=24）。Z组于大鼠左侧后足足底皮下注射酵母多糖1．25mg，制备酵母多糖诱发足底炎性痛模型，PBS组给予等容量PBS100μl。分别于给药前（R）、给药后30min（T1）、1h（T）、2h（T3）、4h（T4）、8h（T5）、24h（T6）和48h（T7）时测定左侧后足机械刺激缩足阈值（MWT）、热缩足反应潜伏期（PWTL）和左侧后足足底最大厚度。PBS组于L时处死8只大鼠，Z组分别于T4、T6和T7时各处死8只大鼠，取左侧脊髓L4-6。节段，采用Westernblot法测定脊髓背角spec—trinαⅡ降解产物、IκBα环氧化酶-2（COX-2）的表达和NF—κB活性。结果与C组比较，Z组MWT降低，PWTL缩短，足底最大厚度增厚，脊髓背角spectrinαⅡ降解产物和COX-2的表达上调，1κBβ表达下调，NF-κB活性升高（P〈0．05或0．01），PBS组上述指标差异无统计学意义（P〉0．05）。结论脊髓背角卡配因活化参与了大鼠足底炎性痛的形成，其机制与激活NF-κB，上调COX-2表达有关。