一种简单快速的食用菌病毒dsRNA提取方法

食用菌病毒病一直是食用菌生产的重要问题,明显影响产量和质量。已发现的食用菌病毒很多为dsRNA病毒,因此dsRNA病毒的研究对于食用菌生产非常重要。发展一种简单快速的食用菌病毒dsRNA的提取方法,该法优化了传统提取方法的步骤和对样品数量的要求,可以从0.5～1.0 g的食用菌组织中快速提取dsRNA,提取效率较传统方法高,提取产物可以直接应用于进行dsRNA的检测、分类以及相关基因的克隆。

注射dsRNA对飞蝗Knickkopf基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率

【目的】本研究旨在评估dsRNA对飞蝗Locusta migratoria Knickkopf(Knk)基因mRNA和蛋白表达的沉默效率,以期为基于RNAi技术探索飞蝗体内基因功能的研究提供基础资料。【方法】选择飞蝗2龄第1天的若虫,将体外合成的飞蝗Knk基因dsRNA注射进入飞蝗体腔内,注射后48,72和96 h分别解剖试虫的腹部表皮,一半用于RT-q PCR方法检测其mRNA表达;另一半用于Western blot法检测其蛋白的表达量。【结果】dsRNA注射进入飞蝗体腔内48,72和96 h后,与对照相比,Knk mRNA水平相对表达量分别降低78.3%,96.2%和95.1%;Knk蛋白表达量分别降低61.2%,33.3%和52.9%。【结论】注射ds Knk能显著沉默飞蝗Knk基因mRNA水平和蛋白水平的表达,但mRNA水平的沉默效率高于蛋白水平。

原核表达dsRNA抗番木瓜畸形花叶病毒的研究

番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一种已对番木瓜种植业构成潜在威胁的新型病害,在转基因植物备受争议的背景下,利用原核表达的dsRNA来防控病毒的策略不失为一种新的选择.本文选取PLDMV CP基因全长（879 bp）,运用OZ-LIC法构建了含有pdk内含子的ihpRNA结构,将其嵌入原核表达载体pSP73中,并转化RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌M-Jm109LacY,构建了1种能高表达dsRNA的原核表达菌株M-Jm109LacY-CP879,以终浓度为0.4 mmol/LIPTG诱导后能够稳定高效的表达CP879-dsRNA.研究共设2个处理：保护性处理与治疗性处理.分别用含有CP879-dsRNA的粗提液对这2个处理的番木瓜植株进行喷施处理,通过统计发病率、观察病症变化以及ELISA分析结果表明,保护性处理能有效抑制番木瓜畸形花叶病毒的侵染,主要表现为发病时间推迟和相对较低的发病率;治疗性处理植株的病毒积累量会在喷施后第3～12天内出现暂时性的降低.结果表明,保护效果优于治疗效果,若每月喷施2～3次dsRNA粗提液,有望能够有效地预防PLDMV的侵染.

葡萄病毒病的双链RNA(dsRNA)检测技术研究

将病毒dsRNA分析检测技术应用到果树病毒的诊断检测上熏并对生产中广泛发生的葡萄卷叶病病毒穴GLRV雪、葡萄扇叶病毒穴GFV雪进行了检测并确立检测标准,为今后葡萄病毒病的诊断检测奠定了良好的基础。同时,还对在葡萄上发生的一种黄边花叶病进行了研究,并获得了这种病毒的dsRNA,证实其为病毒侵染所致。

细菌表达dsRNA介导的家蚕FTZ-F1基因的RNA干扰

为探索细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi技术是否在家蚕Bombyx mori可行,本研究引入了在其他物种中广泛应用的细菌表达dsRNA的RNAi系统:HT115细菌株和L4440质粒。利用L4440载体两端含有T7启动子的特点,设计并构建了针对家蚕核受体FTZ-F1基因的RNA干扰(RNA interference)载体,将构建好的质粒转入大肠杆菌Escherichia coliHT115,在IPTG诱导下成功获得目标基因对应双链RNA(dsRNA)。结果显示:通过对5龄第7天家蚕幼虫注射IPTG诱导后提取的FTZ-F1基因对应的dsRNA25μg,85%的蛹变态发育过程明显延迟,不能实现幼虫到蛹的形态完全转变。荧光定量PCR分析显示目标基因的表达得到了特异的抑制。实验结果初步表明,通过细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi策略,以其经济、高效的特点,具有广泛应用于家蚕基因功能研究中的潜力。

dsRNA介导的RNA干扰沉默烟曲霉色素形成相关基因arp1的研究

目的:用dsRNA介导的RNA干扰(RNAi)特异性沉默烟曲霉色素形成相关基因arp1,使arp1基因mRNA水平降低,产生与母代绿色菌株不同的灰色菌株,类似基因敲除的表型。方法:液氮研磨烟曲霉,提取总mRNA,用含T7启动子序列的特异引物进行RT-PCR,扩增出两端含T7启动子序列的arp1基因,以此为模版使用MEGAscriptRNAiKit体外转录合成dsRNA,用合成的dsRNA电转化烟曲霉后,观察其表型变化,对转化菌进行RT-PCR,分析mRNA变化。结果:转化菌的arp1基因mRNA水平降低,产生与母代绿色菌株不同的灰色菌株,类似基因敲除的表型。结论:RNAi在烟曲霉中的应用使快速敲除靶基因产生类似基因敲除的表型,为研究靶基因功能、识别可能的药物作用靶位奠定了良好的基础。

双链RNA快速小量提取法在水稻dsRNA病毒病诊断中的应用

水稻病毒病是水稻生产中重要的病害，目前国内流行的水稻病毒病病原多为 dsRNA病毒，每一种dsRNA病毒都有特异性基因图谱，为此，探讨了双链RNA快速小量提取法在水稻dsRNA病毒病诊断中的应用。结果表明：1）双链RNA快速小量提取法可以从0．5～0．8 g的水稻组织中快速提取 dsRNA，在3 h内完成对样品的鉴定，提取产物可以直接应用于dsRNA的检测、分类以及相关基因的克隆；2）提取效率较传统方法高，以 SRBSDV为例，传统 dsRNA提取方法中 dsRNA的产率为0．15～0．3μg/g，该方法中dsRNA的产率茎组织达到3μg/g以上，叶组织0．1～0．5μg/g；3）该方法也可以应用于介体体内的dsRNA病毒基因组核酸的提取。

葡萄卷叶病病毒双链RNA(dsRNA)提纯分析研究

以传统的检测方法为对照经过一系列的筛选后 ,在国内首次将病毒的dsRNA检测分析引入果树无病毒苗的检测方法之中 ,确立了葡萄病毒病dsRNA的提取步骤 ,包括试剂选择、浓度的设定、操作方法的确立 ,与国外文献相比有多方面的改进 ,使其更加简单、实用 ,并在实际的应用当中取得成功。在确立方法的基础上对生产中广泛发生的葡萄卷叶病病毒 (GLRv)进行检测并确立检测标准 。

鸡传染性法氏囊病病毒dsRNA的提纯与应用

用传染性法氏囊病病毒 (IBDV)攻击 4周龄的非免疫鸡 ,以超速离心法从感染鸡法氏囊组织中分离、纯化IBDV ,应用蛋白酶K消化和Trizol(异硫氰酸胍 -酚 -氯仿法 )处理 2种方法从纯化的IBDV中抽提dsRNA。通过低熔点琼脂糖割胶 -酚 -氯仿抽提可获得纯化的dsRNA ,研究发现应用蛋白酶K消化获得的纯化RNA产量高 ,用其作模板进行RT -PCR可扩增IBDV基因组全长cDNAA片段和B片段、VP2基因和VP2 - 4 - 3基因。

中华绒螯蟹EsSox21b-like基因干扰载体的构建及原核表达制备dsRNA

Sox(SRY-related HMG-box)基因是一类重要的转录因子,在动物的性别分化与决定、器官的发生等方面具有重要的调控作用。旨在利用RNA干扰技术证实该基因的功能,将EsSox21b-like基因617 bp的片段克隆至含有两个T7启动子的L4440载体上,构建了EsSox21b-like-L4440干扰载体,将该重组载体转化至RNaseⅢ缺陷型的HT115菌株中,经IPTG诱导菌株体内转录,获得了EsSox21b-like正义和反义单链RNA,经过变性、退火形成大量双链RNA(EsSox21b-like-dsRNA),能满足以后应用RNA干扰试验对于EsSox21b-like基因功能的研究。

凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建

为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白(IAP)基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。

诱导提取的dsRNA粗提液对黄瓜绿斑驳花叶病毒的抑制作用

在已测序的黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列的基础上,设计特异引物,扩增全长基因,将其插入到原核表达载体L4440的2个T7启动子之间,构建能诱导形成双链RNA(dsRNA)的原核表达载体L4440-MP,并转化大肠杆菌HT115(DE3),经IPTG诱导,提取了高质量的dsRNA.将提取的dsRNA对黄瓜进行抗病性鉴定,ELISA检测结果表明,提取的dsR-NA能有效地抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染,抗病率达到40%左右.

dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究

目的 观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法 将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞，Western bloting检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达，0．5％锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力。结果 200、300nmol／L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达，而50～200nmol／L浓度的dsRNA有利于干细胞存活。结论 dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时，最大限度地保持细胞活力。

RNAi-dsRNA介导的基因沉默

RNA干涉(RNA interference,RNAi)是双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)现象,广泛存在于线虫、果蝇、植物、真菌及哺乳动物等多种生物体中。作为生物体中存在的一种普遍现象,RNAi是基因组水平的免疫现象,代表了进化过程中原始的基因组对抗来自外来基因表达的保护机制,它介导生物体对内源寄生性核酸及外源性病原核酸的防御,并调控蛋白编码基因的表达,具有十分诱人的应用前景。本文介绍了RNAi的特征、作用机制、生物学功能及其应用等方面的研究进展。

dsRNA和RNA干扰技术

dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。其机的阐明使它有可能在基因敲除 ,基因功能测定等方面成为一项成熟的技术 ,这将在生命科学领域中引起深刻变化。本文就dsRNA和RNA干扰的关系 ,RNA干扰的机制和特点 。

镰形扇头蜱Subolesin基因的长链dsRNA电转化和干扰效果研究

为建立针对不同发育阶段蜱的长链dsRNA电转化导入方法,本研究以我国优势流行的硬蜱镰形扇头蜱为对象,以蜱的保守基因Subolesin作为目标基因,将荧光标记的Subolesin-dsRNA对卵、幼蜱以及若蜱3个发育阶段进行电转化监测dsRNA的转化效果,对电转化后不同时间以及不同dsRNA电转化浓度进行优化,并接种小鼠观察电转化Subolesin-dsRNA对幼蜱及若蜱吸血的影响。结果显示,电转化Cy3荧光染料标记dsRNA后,卵、幼蜱及若蜱体内均有点状分布的荧光。若蜱于电转化后放置8h,Subolesin mRNA沉默效果较佳。此外,卵、幼蜱及若蜱分别在dsRNA浓度为10μg/m L、5μg/m L^25μg/mL及10μg/m L^25μg/m L沉默效果较好。Subolesin-dsRNA干扰后蜱的存活率和吸血能力均显著降低。本研究建立的针对各个发育阶段蜱的高效长链dsRNA电转化方法为研究基因功能和沉默特定的基因提供了新的ds RNA导入方法。

PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达及其在番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系中诱导RNA沉默的研究

为探索利用PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达产物在体外防治番木瓜环斑病毒的可行性,利用较保守的PRSV-NIb基因3′端的312、501和809 bp区段分别构建了含有PDK内含子的3个发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jm109LacY分别作为宿主载体和宿主菌构建了高效的dsRNA原核表达工程菌M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N312、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N501、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N809,经IPTG诱导成功表达了dsRNA,并证明dsRNA不被DNase I和RNase A降解,稳定性较好。还利用PRSV-NIb基因构建了GFP瞬时植物融合表达载体pNIb-GFP,对经3种dsRNA和GFP瞬时融合表达载体共转化的番木瓜叶片原生质体的共聚焦显微镜观察及通过半定量RT-PCR对其中mRNA表达量的分析,结果表明融合基因NIb-GFP的表达均发生了不同程度的下调,说明dsRNA在原生质体中引发了针对同源基因的沉默。

应用dsRNA介导的RNAi对烟曲霉菌生命必须基因的研究

目的初步探讨应用RNAi研究烟曲霉菌必须基因的方法。方法液氮研磨烟曲霉菌,提取总mRNA,用含T7启动子序列的特异引物进行RT-PCR,扩增出两端含T7启动子序列的nudC基因,以此为模版使用MEGAscriptTMRNAi Kit体外转录合成dsRNA,用合成的dsRNA电转化烟曲霉菌后,观察烟曲霉菌表型变化,对转化菌进行RT-PCR,分析mRNA变化。结果电转化后,转化菌的nudC基因mRNA水平降低,与18srRNA的比值为0.50±0.07,显著低于零对照1.09±0.06和无关对照1.10±0.09(F=9.38,P<0.05);烟曲霉菌生长受到抑制,类似基因敲除的表型。结论应用dsRNA介导的RNA能沉默烟曲霉菌靶基因,产生类似基因敲除的表型,为研究靶基因功能,识别烟曲霉菌生命必须基因,寻找新的抗菌药物作用靶位奠定了良好的基础。

外源注射CART特异性dsRNA对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响

选择500只健康、20周龄的海兰褐蛋鸡,预饲30 d后随机平均分为5组,每组4个重复,分别进行如下处理:生理盐水仅第1天注射一次组(A组,对照组)、可卡因—苯丙胺调节转录肽(CART)特异性双链RNA(dsRNA)仅第1天注射一次组(B组)、CART dsRNA每40 d注射一次组(C组)、CART dsRNA每20 d注射一次组(D组)、CART dsRNA每10 d注射一次组(E组),120 d后对各处理组蛋鸡的产蛋性能、蛋品质、蛋组分和体重变化进行测定,研究CART对产蛋期蛋鸡的产蛋性能和蛋品质的影响.结果表明:各试验组之间以及与对照组之间在产蛋率上均存在差异(P<0.05);B组的日产蛋量与对照组的差异不显著,其他试验组与对照组的差异显著(P<0.05);各试验组的采食量均高于对照组(P<0.05);从蛋料比来看,B、C组与对照组的差异不显著,D组与E组的差异不显著,但均与对照组存在差异(P<0.05);各试验组蛋品质、蛋组分与对照组的差异不显著;试验结束后,各试验组蛋鸡的体重变化与对照组均存在差异(P<0.05).总之,CART dsRNA对海兰褐蛋鸡产蛋性能和体重变化的影响显著,对蛋品质和蛋组分的影响不显著.