沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化

【目的】细菌DNA磷硫酰化修饰是指DNA骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE。本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC在DNA磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础。【方法】以沙门氏菌总DNA为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaI和XhoI位点之间,构建融合表达载体pJTU3622;将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆;提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主[E.coli BL21(DE3)pLysS],获得工程菌株Anxh103;优化表达条件,诱导表达dptC基因;采用GST-Trap柱和kata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白。【结果】获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxh103;确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8-18 h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50μmol/L Fe2+。【结论】成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达;表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础;沙门氏菌DptC发酵体系中添加50μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe-4S的铁硫蛋白。

Salmonella enteric硫修饰蛋白DptC半胱氨酸定点突变对Dnd表型的影响

【目的】Salmonella enterica serovar Cerro 87是具有硫修饰现象即Dnd表型的细菌之一,其硫修饰受dptBCDE基因簇控制,将dptBCDE克隆、转化Escherichia coli DH10B后,可赋予后者Dnd表型,而当其中dptC缺失后,Dnd表型随之丧失。本文探索S.enterica serovar Cerro 87硫修饰基因dptC在硫修饰发生过程中的作用。【方法】将DptC中6个半胱氨酸(Cys)在DNA水平上逐个定点突变,转化携带dptBCDE及其衍生系列的质粒至E.coli DH10B,检测相应受体菌Dnd表型。【结果】在DptC的6个Cys中,除C39外,其余5个突变均可导致Dnd表型丧失,说明DptC中C146、C262、C273、C280和C283均与硫修饰有关。生物信息学分析表明,这5个Cys在硫修饰细菌科属间高度保守,佐证了S.enteric DptC中这5个Cys与硫修饰有关的结论。【结论】S.enteric DptC中C146、C262、C273、C280和C283任何一个的突变,都会导致受体菌Dnd表型丧失。该结果为进一步探索DNA硫修饰的发生机制提供了线索。