巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析

用卡那霉素盒（Ｋｍｒｃａｓｅｔｅ）插入法，对巴西固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）Ｙｕ６２的ｄｒａＴＧ基因及其下游区域进行了诱变，并获得相应的突变株。研究表明：ｄｒａＴ变突株的固氮酶活性不再受铵抑制，而ｄｒａＧ突变株在有铵时则丧失固氮酶活性，但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。ｄｒａＴＧ下游区域突变株ＹＺ４（突变位点距ｄｒａＧ约２ｋｂ）在无氮及限铵条件下，其固氮酶活性比野生型菌株的高，但其ｎｉｆＨｌａｃＺ转录融合子的表达并不受影响。

巴西固氮螺菌 Yu62 draTG 基因启动子区域的核苷酸序列及其功能分析

对巴西固氮螺菌ｄｒａＴＧ上游区域进行了全序列分析，结果表明该区域除了编码部分ｎｉｆＨ基因外（ｎｉｆＨ与ｄｒａＴＧ转录方向相反），不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列，它们包括上游激活序列（ＵＡＳ）、下游启动子组份（ＤＰＥ）和富Ａ＋Ｔ区。这说明：ｎｉｆＨ与ｄｒａＴ间的区域可能主要起调控功能而非编码功能；ｄｒａ操纵元（ｏｐｅｒｏｎ）的启动子很可能是ＲｐｏＮ－依赖型。用ｐＡＦ３００做载体，构建了ｄｒａＴ∷ｃａｍ转录融合质粒ｐＡＴ１，并通过检测Ｃｍｒ以检测ｄｒａＴ在大肠杆菌和巴西固氮螺菌中的表达，结果表明ｄｒａＴ在ＬＤ丰富培养基上，好氧条件下，只在巴西固氮螺菌中才表达。这说明，ｄｒａＴ的转录需要某种大肠杆菌中没有的因子，同时也表明ｄｒａＴＧ上游区域有启动子功能。利用启动子探针质粒载体ｐＣＢ１８２，构建了ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ转录融合质粒ｐＣＴ１。在大肠杆菌中测定肺炎克氏杆菌ＮｉｆＡ对ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ的转录激活作用。结果表明ｎｉｆＡ并不参与ｄｒａＴ的转录调控。

巴西固氮螺菌Yu62draTG基因及其下游区域的克隆与核苷酸序列分析

以ＡｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＳｐ７４．０ｋｂｄｒａＴＧ片段为探针，自Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＹｕ６２的基因文库中克隆了约８ｋｂ的ｄｒａＴＧ同源片段。通过对该片段的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析发现Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅＹｕ６２的ｄｒａＴＧ基因定位在３０ｋｂＥｃｏＲＩＫｐｎＩ片段上，其上游与ｎｉｆＨ基因相邻。ＤＮＡ序列分析结果表明：该片段含有完整的ｄｒａＴＧ，这两个基因下游还有两个开放阅读框架（ＯＲＦ３和ＯＲＦ４，其中ＯＲＦ４是不完整的），ｄｒａＴＧ及下游的ＯＲＦ３推测以一个操纵元的方式转录；在ｄｒａＧ及ＯＲＦ３的上游区域均发现σ５４依赖型启动子的特征序列（ＤＰＥ及ＵＡＳ），推测它们与ｄｒａＴ共转录外，还有可能单独转录。同源比较的结果表明Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｕｍ的ＤｒａＴＧ是非常保守的，它们在菌株及种间的差异都很小；紧接着ｄｒａＧ的ＯＲＦ３除与Ａ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ和Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｕｍｒｕｂｒｕｍ相应位置的ＯＲＦ同源外，还与Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉ的ＯＲＦ１４同源；