ZNRD1小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

目的:探讨转录相关锌带蛋白基因(zincribbondomaincontaining1protein,ZNRD1)作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性。方法:Westernblot检测ZNRD1在白血病细胞中的表达;构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL60/VCR细胞,G418筛选稳定转染细胞株;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Westernblot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白bcl2、Bax和耐药相关蛋白Pgp、MRP的表达变化。结果:ZNRD1在HL60/VCR细胞中的表达明显高于HL60细胞;成功建立了低表达ZNRD1的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达Pgp和bcl2。结论:该小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转了白血病细胞的耐药性。

重组腺病毒介导的FLT3配体和阿霉素联合治疗小鼠肝癌

目的:将重组腺病毒介导的FLT3配体(FLT3 ligand,FL)与阿霉素(adriamycin,ADM)联合治疗小鼠肝癌,探索基因治疗和化疗相结合治疗肿瘤的新方法。方法:构建携带鼠FL的重组腺病毒载体(AdmFL),单独用其或ADM以及两者联用对实验性肝癌小鼠进行治疗,观察抗肿瘤效果。结果:(1)FL+ADM组小鼠肝癌生长抑制率最大值为56.5％,明显高于ADM组和FL组的27.5％和26.6％(P<0.01);(2)FL+ADM组小鼠早期死亡率为8.3％,明显低于ADM组的37.5％(P<0.01);FL十ADM组小鼠长期生存率为86.4％,明显高于ADM组和FL组的50.0％和41.5％(P<0.01)。结论:(1)FL和ADM治疗小鼠肝癌具有协同作用,FL可显著增强化疗效果;(2)FL能明显降低化疗不良反应。

三种补肾中药有效成分对皮质酮致骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞基因表达谱的作用

目的:观察3种补肾中药淫羊藿、补骨脂和女贞子各自的有效成分淫羊藿苷、补骨脂素和齐墩果酸对皮质酮大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowstromal cell,BMSC)的调控作用。方法:50只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、模型组、淫羊藿苷组、补骨脂素组、齐墩果酸组(后3组合称治疗组)。模型组和治疗组予皮质酮皮下注射,每日1次,连续14d。正常对照组予等剂量橄榄油皮下注射。治疗组皮质酮注射前5d开始按20mg/kg给予对应药物每日1次灌胃,连续19d。分别于造模第1、4、7、11和14天称量体质量,大鼠处死后取第4腰椎进行Micro-CT扫描,评价骨量改变情况。采用全骨髓贴壁培养法培养原代BMSC,于取材后第7天干细胞基因芯片技术检测mRNA表达。结果:造模和治疗后各组大鼠体质量没有发生明显变化。Micro-CT显示,皮质酮注射14d后,模型组与正常对照组之间,治疗组与模型组之间腰椎骨形态计量学参数未出现显著变化。干细胞基因表达谱显示在皮质酮改变的基因中,淫羊藿苷、补骨脂素和齐墩果酸分别可逆转11、12和15种基因。3个有效成分共同作用的基因有5种,涉及成骨分化、细胞周期调节、细胞代谢和Notch信号通路。结论:补肾中药可能从BMSC周期调节和细胞代谢等方面发挥促进BMSC成骨分化的作用,最终实现治疗骨质疏松的疗效,但其确切的机制还有待深入研究。

海螵蛸对骨愈合相关基因表达的影响

为揭示中药海螵蛸在骨折愈合过程中的干预作用 ,了解海螵蛸的调节靶点 ,探索建构中药基因组学的途径。通过在大鼠胫骨打孔的方法建立单因素干扰模型 ,在不同时间点采用原位杂交方法对各类mRNA的变化进行动态观察骨愈合过程中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA、转化生长因子 (TGG) β1mRNA、骨形态发生蛋白 (BMP) 2mRNA、血管内皮生长因子 (VEGF)mRNA表达情况。结果显示 ,海螵蛸在骨折早期对Ⅰ、Ⅲ 型前胶原mRNA、VEGFmRNA、BMP 2mRNA的表达升高 ,而对Ⅱ型前胶原mRNA、TGF β1mRNA的表达量无明显影响 ;但达到峰值后 ,Ⅱ、Ⅲ 型前胶原mRNA表达水平下降 ,VEGFmRNA、TGF β1mRNA表达量中后期维持于较高水平。表明海螵蛸与血管形成有关 ,对骨折软骨形成早期具有促进骨诱导的作用 。

基于生物信息学的乳腺癌关键基因筛选及实验验证

目的:通过利用生物信息学技术,筛选乳腺细胞癌组织与正常组织间的差异表达基因,明确其潜在治疗药物,为将来临床乳腺癌的免疫靶向治疗及药物治疗提供参考。方法:利用基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)检索关键词“乳腺癌”,下载GSE79586芯片数据,通过生信技术筛选对照组及乳腺癌模型组差异表达基因并对其进行基因本体(GO)功能分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析、差异基因特征表达分析以及蛋白互作网络(PPI)分析,对分析结果进一步可视化处理。通过GEPIA、GeneMANIA、Timer2.0数据库分别进行预后分析、相关功能预测以及免疫浸润分析。最终通过Connectivity Map(CMap)明确对乳腺癌具有潜在治疗作用的化合物。采用蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR(RT-PCR)对核心基因及相关性最高的潜在治疗药物吉非替尼进行体外验证。结果:共筛选到包括1786个上调基因和2130个下调基因在内的3916个差异表达基因;GO结果显示差异基因主要参与磷酸化的正向调节、分泌囊泡、外消旋酶和差向异构酶活性等功能;KEGG结果显示差异基因主要参与系统性红斑狼疮、酒精中毒、粘着斑、阿米巴痢疾等疾病通路与Ras信号通路等;差异基因特征表达分析显示MEK抑制剂、HSP90抑制剂以及信号转导通路激酶抑制剂等是与差异基因相似的药物;PPI结果显示H2AFJ、TFF1、GATA3、FOXA1、CDH1等是与乳腺癌相关的核心基因;进一步选取相关性最高的H2AFJ、TFF1两个核心基因进行GEPIA分析。分析结果显示,原发性乳腺癌细胞组织中H2AFJ与TFF1 mRNA表达显著高于正常组织,并且与原发性乳腺癌细胞患者的病理分期、总生存率以及无病生存率存在显著相关性(P<0.01);H2AFJ与TFF1可能是影响乳腺癌细胞患者生存的潜在预后生物标志物;差异表达的H2AFJ与TFF1功能主要分别与激素受体结合、上皮结构维持和基因表观遗传负调控、参与转录负调控的染色质组织等过程有关;免疫浸润结果显示,H2AFJ与TFF1的表达与巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、CD4^(+)T、CD8^(+)T以及B淋巴细胞等免疫细胞的浸润存在着显著相关性;CMap结果显示吉非替尼、阿培利西、索拉菲尼、舒尼替尼等化合物对乳腺癌具有潜在的治疗作用。Western blot和RT-PCR结果显示,H2AFJ与TFF1在乳腺癌细胞中显著高表达,吉非替尼可明显抑制乳腺癌细胞中H2AFJ与TFF1的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:本研究通过生物信息学手段筛选出乳腺细胞癌组织与正常组织间差异表达基因,明确在乳腺癌发病进程中的关键基因及具有潜在治疗效果的化合物,进一步通过实验验证了所筛选药物对乳腺癌的有效性。为今后临床针对乳腺癌的新药研发提供参考,以便开发更有效的治疗方案。

RNA干扰抑制HOXA7表达能逆转白血病U937细胞多药耐药

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制同源盒基因A7(homeobox geneA7,HOXA7)表达,并探讨其对白血病U937细胞多药耐药的逆转作用。方法:将靶向HOXA7基因的特异性真核表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7)及阴性对照载体(pGPU6/GFP/Neo-shNC)分别转染U937细胞,G418稳定筛选。实验分3组:实验组(稳定表达pGPU6/GFP/Neo-shHOXA7的U937细胞)、阴性对照组(稳定表达pGPU6/GFP/Neo-shNC的U937细胞)和空白对照组(U937细胞)。RT-PCR和蛋白质印迹法分别在mRNA和蛋白质水平检测各组细胞中HOXA7的表达情况。MTT法检测各组细胞对阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)和高三尖杉酯碱(homo harringtonine,HHT)的敏感性。FCM法分别检测Ara-C(10μg/mL)和HHT(0.5μg/mL)作用下各组细胞的凋亡情况。结果:实验组HOXA7在mRNA和蛋白质水平的相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。实验组Ara-C和HHT的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50)较阴性对照组和空白对照组的IC50分别降低了3.5倍和8.5倍(P<0.05),提示实验组细胞对Ara-C和HHT的敏感性增加。实验组细胞分别经Ara-C(10μg/mL)和HHT(0.5μg/mL)诱导后,细胞凋亡率明显高于相同药物作用下阴性对照组和空白对照组的细胞凋亡率(P<0.05)。结论:RNAi抑制HOXA7表达能增强Ara-C和HHT对U937细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用,在一定程度上可逆转白血病细胞的多药耐药性。

RNA干扰同源盒A10基因表达可逆转白血病K562细胞多药耐药性

目的:本研究通过建立高效干扰同源盒A10(homeobox A10,HOXA10)基因表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,探讨RNA干扰技术逆转人慢性髓系白血病K562细胞株多药耐药的新方案。方法:构建靶向HOXA10基因的真核表达载体pGPHI/GFP/Neo-HOXA10,应用阳离子脂质体将其转染入K562细胞,G418筛选4周。RT-PCR鉴定重组载体稳定转染的细胞株。MTT法检测细胞在转染前后对长春新碱(leurocristine,VCR)、足叶乙苷(etoposide,VP-16)的敏感性变化。FCM法检测各组细胞的凋亡率。结果:经G418筛选后,反转录PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR)证实成功建立了pGPHI/GFP/Neo-HOXA10稳定转染的细胞克隆。MTT结果显示,基因干扰组细胞的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50)值明显低于对照组(P<0.05),对VCR及VP-16的敏感性明显增强。FCM检测结果表明,基因干扰组细胞联合化疗药物后细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。而转染阴性对照组的IC50值及细胞凋亡率与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:以HOXA10基因为靶标构建的shRNA表达载体能明显增强VCR和VP-16对K562细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用,提高白血病细胞对化疗药物的敏感性。提示HOXA10基因表达被RNA干扰可以在一定程度上逆转白血病细胞的多药耐药性。

腺病毒载体介导的发夹状RNA抑制三氧化二砷耐药的K562/AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

目的 构建MRP1特异性发夹状RNA（shRNA）重组腺病毒载体,并研究其对耐三氧化二砷（ATO）的白血病K562/AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用.方法 构建MRP1特异性shRNA重组腺病毒,并感染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR法分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达;MTT法检测该细胞对ATO及依托泊苷（VP16）的细胞毒作用.结果 pAd-EGFP-U6.MRP1.shRNA重组腺病毒感染前后,K562/AS2细胞中MRP1 mRNA和蛋白表达水平分别为（34.70±0.28）、（4.19±0.03）（P〈0.05）和（26.40±0.16）、（10.85±0.37）（P〈0.05）;感染前后K562/AS2细胞对ATO及VP16耐药倍数分别为（11.4078±0.3183）、（1.6126±0.3015）和（5.9141±0.0149）、（1.7664±0.1038）,逆转倍数分别为（7.2409±1.3668）和（3.3555±0.1886）（P〈0.05）.结论 成功构建了pAd-EGFP-U6-MRP1-shRNA重组腺病毒载体,该载体感染K562/AS2细胞后可抑制细胞MRP1基因表达以及逆转该细胞对ATO和VP16的耐药.

c—fos反义寡核苷酸对兔实验性增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用

目的评价c—fos反义寡核苷酸（AS-ON）对兔实验性增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的抑制作用。方法将9只兔（18只眼）分为c—fos—AS-ON治疗组和对照组（每组9只眼）。c—fos—AS—ON治疗组以平衡盐溶液（BSS）配制2pgc—fos—AS—ON和10μg脂质体的混合液0．1ml、对照组以0．1mlBSS分别与2．5×10^5个／ml人视网膜色素上皮（RPE）细胞稀释液混合后同时注入玻璃体腔，观察两组在玻璃体腔注射后第7、14、21、28天PVR发生的程度。结果随着观察时间的延长，两组PVR程度逐渐加重。第7天两组PVR程度无统计学差异（P=0．05），第14、21、28天，c—fos—AS-ON治疗组的PVR程度较对照组轻，差异有统计学意义（P〈0．05）；第28天，c—fos—AS—ON治疗组牵拉性视网膜脱离发生率为25．0％，对照组为62．5％。结论c—fos—AS—ON对兔实验性PVR的发生有一定的抑制作用。

黄芪注射液对模拟高原缺氧环境大鼠视网膜缺氧诱导因子-1α、p53表达的影响

目的 观察探讨黄芪注射液对模拟高原缺氧环境大鼠视网膜组织的影响及其机制。方法 成年健康Sprague Dawley大鼠60只随机分为黄芪注射液干预组（干预组）和生理盐水对照组（对照组），每组各30只。干预组大鼠按15 ml/kg剂量腹腔注射黄芪注射液，对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。注射后30 min，两组各按随机数字表选取6只大鼠分别饲养于模拟海拔为5000 m、氧分压11.3 kPa的高原环境模拟实验舱2、6、8、12、24 h；每一时间点均为6只大鼠。不同在舱时间大鼠出舱后处死摘除眼球，分别行石蜡切片苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色，观察大鼠视网膜病理形态变化以及视网膜组织中缺氧诱导因子-1α（HIF -1α）、p53的表达变化。结果 对照组大鼠在舱时间2 h即可观察到视网膜各层组织疏松水肿，HIF -1α、p53主要表达于视网膜各层细胞浆中。随在舱时间延长，视网膜神经纤维层萎缩，神经节细胞肿胀变性，层次排列紊乱；HIF -1α、p53表达增加。与对照组大鼠比较，各相应在舱时间干预组大鼠视网膜组织形态改变相同，但程度更轻；HIF -1α、p53表达下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 黄芪注射液能减轻高原缺氧环境下大鼠视网膜组织病理损害，其作用机制可能与下调HIF -1α、p53表达有关。

抑制HSP90活性可逆转人肝癌HepG2/ADR细胞对多柔比星的耐药性

目的:检测热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)抑制剂格尔德霉素(geldanamycin,GA)对人肝癌耐多柔比星(adriamycin,ADR)HepG2/ADR细胞耐药性的影响,并进一步探讨其可能的作用机制。方法:用不同浓度的ADR(50、100、150、200和250μmol/L)处理HepG2/ADR细胞后,分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测多药耐药1(multiple drug resistance 1,MDR1)基因mRNA及其编码的蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达情况,筛选出能引起MDR1 mRNA和P-gp表达水平显著升高的ADR浓度。将HepG2/ADR细胞维持培养于筛选获得的ADR浓度中,随后分别加入不同浓度的GA(0、100、200、400、600和800 nmol/L)处理细胞24 h,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测GA对HepG2/ADR细胞中HSP90、突变型p53(mutation p53,Mut-p53)、转录因子SP1(specifi city protein 1)、MDR1mRNA及其蛋白表达的影响;FCM法检测GA对HepG2/ADR细胞摄入ADR能力的影响;MTT法检测的GA联合ADR对HepG2/ADR细胞增殖的影响。结果:当ADR浓度为200μmol/L时,与对照组(未用ADR处理)相比,MDR1 mRNA和P-gp的表达水平分别上调了76.8%和89.3%(P值均<0.01)。将细胞培养于含200μmol/L ADR的细胞培养液中,梯度增加GA的浓度。结果发现与阴性对照(ADR单药作用)组相比,当GA浓度达到100 nmol/L时,HepG2/ADR细胞中MDR1 mRNA和P-gp的表达水平均显著降低(P<0.01和P<0.05)。当GA浓度为800 nmol/L时,HepG2/ADR细胞内MDR1 mRNA和P-gp的表达水平分别降至阴性对照的58.6%和38.3%(P值均<0.01)。FCM法检测结果显示,GA可以增加HepG2/ADR细胞对ADR的摄取量,与阴性对照组相比,当GA浓度为800 nmol/L时,ADR在细胞内的积聚量从13.6%上升至59.7%(P<0.01)。MTT法检测结果显示,联合用药组中GA对HepG2/ADR细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值为(263.8±5.3)nmol/L,显著低于GA单独作用于HepG2/ADR细胞的(735.5±2.8)nmol/L(P<0.01)。结论:GA能逆转HepG2/ADR细胞对ADR的抗药性,其机制可能是通过HSP90/Mut-p53/SP1信号通路,阻止MDR1基因的转录和表达而实现的。

腺病毒介导Tum5重组基因对高糖刺激下恒河猴视网膜血管内皮细胞增生、迁移及管腔形成的影响

目的观察腺病毒介导Turn5重组基因对高糖刺激下恒河猴视网膜血管内皮细胞（RF／6A细胞）增生、迁移及管腔形成的影响。方法构建空载体病毒rAd-绿色荧光蛋白（GFP）和携带Tum5基因的重组腺病毒表达载体（rAd—Tum5）。分别感染RF／6A细胞，流式细胞仪检测感染效率。细胞感染48h后，采用蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测Tum5重组基因体外表达。将RF／6A细胞分为正常对照组、高糖刺激对照组（HG组），空载体对照组（HG＋rAd—GFP组），Tum5基因组（HG＋rAd—Tum5组）。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）、侵袭小室（Transwell）实验及基质胶（Matrigel）实验分析Tum5重组基因对高糖刺激下RF／6A细胞增生、迁移及管腔形成的影响。结果流式细胞仪检测结果显示，tAd—GFP、rA＆Tum5感染细胞的效率分别为55．13％、50．31％。Westernblot检测结果显示，HG＋rA＆Tum5组在相对分子质量14×10^3左右处可见Tum5蛋白表达条带；正常对照组、HG组、HG＋rAd—GFP组均未见Tum5蛋白表达条带。CCK-8、Transwell实验及Matrigel实验结果显示，正常组、HG组、HG＋rAd-GFP组、HG＋rAd-Tum5组4组间细胞增生数量、迁移数量及成形管腔数量比较，差异均有统计学意义（F-44．484、772．666、137．696，P（0．05）。组间细胞增生数量、迁移数量及成形管腔数量两两比较结果显示，HG组较正常对照组增加，差异有统计学意义（P〈0．05）；HG组与HG＋rAd—Tum5组之间无明显差异（P〉0．05）；HG＋rAd—Tum5组较HG组、HG＋rAd—GFP组明显减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论腺病毒介导Tum5重组基因可抑制高糖刺激下RF／6A细胞的增生、迁移及管腔形成。

近交系小鼠C57BL/6和C57BL/10的转录组差异研究

目的:对近交系小鼠C57BL/6和C57BL/10进行转录组测序,对比其转录组差异,发现免疫反应相关差异基因,为药物体内活性评价动物选择提供参考。方法:采用Illumina Hiseq 2000测序平台进行测序,通过短序列分析获取转录本,通过基因功能分类(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行测序结果分析。结果:获得38 553 614个C57BL/6小鼠的原始序列和37 721 318个C57BL/10小鼠的原始序列。获得118 002个转录本,注释了46 193个差异基因。38 106个转录本注释到2 196个GO分类中,GO分类主要分为3类:细胞成分,分子功能和生物过程。1 600个转录本注释到254个KEGG通路中。另外,发现了4 651个单核苷酸(SNP)位点。结论:通过二代测序方法发现近交系小鼠C57BL/6和C57BL/10转录组存在显著差异基因。在KEGG通路分析中筛选了一系列与小鼠免疫应答相关的差异基因,为建立小鼠免疫评价模型积累了数据,对药物实验动物体内活性检测分析具有参考意义,为生物制品评价用实验动物的标准化提供技术支撑。