Fv抗体研究的新进展──二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)

单链抗体（ｓｃＦｖ）虽然有诸多优点，如分子小，易通过血管壁，穿透实体瘤，但其稳定性差，亲和力较低。近年来出现了二硫键稳定性Ｆｖ抗体（ｄｓＦｖ），就是在ＶＨ和ＶＬ间通过形成二硫键来稳定Ｆｖ片段，ｄｓＦｖ极大地提高了Ｆｖ片段的稳定性和亲和力，不仅继承了ｓｃＦｖ的优点，也弥补了其缺点，从而极大地提高了ｄｓＦｖ和ｄｓＦｖ－免疫毒素在临床上的应用价值。

抗HBsAg二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)基因的构建与表达

采用ＰＣＲ定点突变方法，成功地构建了抗ＨＢｓＡｇｄｓＦｖ抗体的轻、重链突变基因，ＮｄｅＩ和ＥｃｏＲＩ酶切后分别插入ｐＥＴ２０ｂ表达质粒，经测序证明在重链第４４位氨基酸和轻链第１００位氨基酸已突变形成半胱氨酸（Ｃｙｓ）。ＶＨ和ＶＬ重组质粒分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，ＩＰＴＧ诱导后，经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳表明在１２ｋＤ处有包含体蛋白表达，表达蛋白含量分别为２８％和３５％。ＶＨ和ＶＬ包含体蛋白经ＧｕＨＣｌ变性后，等量混合在复性折叠液中结合，形成了一个约２４ｋＤ并有一定活性的ｄｓＦｖ蛋白。抗ＨＢｓＡｇｄｓＦｖ抗体表达及复性的成功，为今后基因工程抗体的研究及应用奠定了基础。

抗HBsAg二硫键稳定性Fv抗体(dsFv)突变基因的构建与序列分析

ｄｓＦｖ是近年发展起来的一种新型基因工程抗体，具有分子小，稳定性好，生物学活性高等特点。我们采用ＰＣＲ定点突变方法，成功地构建了抗ＨＢｓＡｇｄｓＦｖ抗体的轻、重链突变基因，并进行了序列分析，证明在重链第４４位氨基酸和轻链第１００位氨基酸，已突变形成半胱氨酸（Ｃｙｓ），为进一步表达有活性的抗ＨＢｓＡｇｄｓＦｖ抗体奠定了基础。

抗肝癌hdsFv融合RC-RNase重组免疫毒素的表达、纯化及活性测定

目的制备有临床应用前景的特异性高、稳定性强的新型抗肝癌重组免疫毒素。方法利用IPTG诱导抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素在大肠杆菌中表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析法纯化并复性,应用免疫细胞化学和MTT的方法分别检测其对人肝癌细胞的特异性结合和杀伤活性。结果重组免疫毒素以可溶性形式在大肠杆菌中获得表达。免疫细胞化学和细胞毒实验表明其能够特异性地结合并杀伤肝癌细胞,并且能够保持较强的稳定性。结论我们抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组免疫毒素的成功制备,为其进一步的临床应用研究奠定了一定的实验基础。

人源抗-HBsAg dsFv-IFN融合基因的构建及在CHO细胞中的表达

目的 :探讨用抗体工程技术研制乙型肝炎导向干扰素。方法 :在已有的抗HBsAg_dsFv的基础上 ,用重叠延伸PCR的方法将抗_HBsAg_dsFvVL 基因和α_干扰素基因连接 ,形成融合基因。为避免IFN与dsFv空间折叠的影响 ,其间引入 15个氨基酸的柔性短肽 ;分别构建重链VH 基因、轻链VL_IFN融合基因的CHO表达载体 ,共转染CHO细胞。结果 :从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在 ,有抗_HBsAg活性 ,但dsFv与抗原的结合活性较低。结论 :本研究为研制乙肝导向干扰素奠定了基础。

二硫键稳定的抗肝癌人源化Fv-突变体人TNFα融合基因的构建与表达

利用引物PCR和重叠延伸PCR法,将抗肝癌人源化抗体hscFv25重链可变区和轻链可变区各定点突变出一个半胱氨酸,将hTNFα改造成高抗肿瘤活性的突变体,分别原核表达重链可变区突变体、轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因,然后将两种表达的产物混合进行复性,目的获得具有高稳定性和高抗肿瘤活性的抗肝癌靶向细胞因子。结果重链可变区突变体和轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因在大肠杆菌中均获得高效表达表达产物以包涵体形式存在,混合复性结果未获得活性产物。

柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及表达产物的生物学活性分析

【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coliBL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23kD,并将其成功复性,复性后大小为46kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。

可复制型抗乙肝免疫基因治疗剂pSVK-HBVE的构建与表达

目的构建能同时表达抗体小分子靶向干扰素(dsFvα)和人白介素12(hIL-12)的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE。方法将pVAX-HBVE质粒双酶切,回收dsFvα-IRES-hIL12片段;将dsFvα-IRES-hIL12片段克隆入早期构建的pSVK载体,得到重组质粒pSVK-HBVE。将重组质粒瞬时转染到293T细胞,ELISA法检测目的基因表达;提取重组质粒pSVKHBVE,注射乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转基因小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果pSVK-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pSVK-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够同时表达抗体靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的可复制型抗乙肝免疫基因治疗质粒,为慢性乙肝免疫基因治疗提供新的备选方案。

抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究

目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体。通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性。结果获得dsFv抗体蛋白约2.1mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性。结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能。

HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。