设计改造羧酸还原酶合成医药中间体(S)-2-氨基丁醇

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件。以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combinatorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N)。该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(kcat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃。进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物。XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99%,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60%。通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导。

双酶辅助水蒸气蒸馏法提取肉豆蔻精油及其GC-MS成分分析

采用双酶辅助水蒸气蒸馏法提取广西产肉豆蔻的精油,并通过GC-MS对其进行成分分析。正交实验结果表明,最优提取工艺条件为加酶量2%、酶解pH 4.0、酶解温度40℃,在此条件下,肉豆蔻精油的得率为6.50 mL/100 g。利用GC-MS和保留指数法从精油中鉴定出56种化合物,占精油总量的99.71%,主要成分为肉豆蔻醚(16.60%)、甲基丁香酚(14.78%)、桧烯(13.47%)、(+)-柠檬烯(7.29%)、4-萜烯醇(6.75%)、榄香素(6.62%)、γ-松油烯(4.28%)、反式-甲基异丁香酚(3.73%)、β-蒎烯(3.59%)和黄樟素(3.22%)。

DNAzyme@CuSNPs dual mimic enzyme probe-amplified chemiluminescent imaging array immunosensor for multiple chicken cytokines detection

The detection of cytokines plays an important role in clinical diagnosis and immune mechanism research of chicken diseases.In this work,a novel and ultrasensitive chemiluminescent(CL)imaging array immunosensor was proposed to detect multiple chicken cytokines based on DNAzyme@CuS nanoparticles(DNAzyme@CuSNPs)dual mimic enzyme signal amplification strategy.DNAzyme@CuSNPs owns excellent peroxidase property,which was modified with second antibody(Ab_(2))to prepare DNAzyme@CusNPs detection probe,and demonstrated high catalysis CL imaging signal due to synergistic catalysis.Chicken interleukin-4(ChIL-4)and chicken interferon-y(ChIFN-y)were used as model analysis samples,the DNAzyme@CusSNPs-based CL imaging immunosensor achieved simultaneous and high-throughput detection of ChIL-4 and ChIFN-y with wide linear range of 10^(-3)-10^(2) ng/mL,and the detection limits are 0.41 pg/mL and 0.36 pg/mL,respectively.The multiplex chicken cytokines CL imaging array immunosensor shows a high sensitivity,wide linear range,excellent specificity and acceptable stability.This research opens dual mimic enzyme signal-amplified strategy to develop sensitive CL imaging immunoassay for chicken diseases detection application.

调整的抗血小板聚集治疗方案对老年未破裂颅内动脉瘤介入治疗围手术期缺血事件发生的影响分析

目的 探索应用细胞色素P450 2C19(CYP2C19)基因检测调整抗血小板聚集治疗方案对老年未破裂颅内动脉瘤支架辅助弹簧圈栓塞围手术期缺血事件的影响。方法 回顾性连续纳入2018年1月至2021年12月中国科学技术大学附属第一医院神经外科行介入治疗的老年(年龄≥60岁)未破裂颅内动脉瘤住院患者343例,依据中国科学技术大学附属第一医院开始开展CYP2C19基因检测技术的时间(2021年1月),将343例老年未破裂颅内动脉瘤患者分为非基因检测组(2018年1月至2020年12月)和基因检测组(2021年1—12月)。非基因检测组采用常规抗血小板聚集治疗方案(阿司匹林100 mg/次和氯吡格雷75 mg/次,1次/d),基因检测组根据CYP2C19基因检测结果调整抗血小板聚集治疗方案(对于超快代谢型及快代谢型患者,给予阿司匹林肠溶片100 mg/次和氯吡格雷75 mg/次,1次/d;对于中间代谢型及慢代谢型患者,给予阿司匹林肠溶片100 mg/次1次/d和替格瑞洛90 mg/次2次/d),比较两组术中及术后1个月内发生缺血事件的差异,同时对影响缺血事件的相关因素进行单因素分析和多因素Logistic回归分析。结果 343例老年未破裂颅内动脉瘤患者中,非基因检测组181例,基因检测组162例。(1)非基因检测组与基因检测组患者性别、年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟史、颅内动脉粥样硬化、动脉瘤大小、动脉瘤部位、支架类型、动脉瘤栓塞程度、出血事件的差异均无统计学意义(均P>0.05);基因检测组缺血事件发生率低于非基因检测组,组间差异有统计学意义[4.9%(8/162)比11.6%(21/181),χ^(2)=4.905,P=0.027]。(2)发生缺血事件组与未发生缺血事件组患者性别、年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症、动脉瘤大小、动脉瘤部位、动脉瘤栓塞程度的差异均无统计学意义(均P>0.05);未发生缺血事件组患者吸烟、颅内动脉粥样硬化、使用编织型支架比例均低于发生缺血事件组[14.6%(46/314)比31.0%(9/29);17.2%(54/314)比37.9%(11/29),χ^(2)=7.430;24.2%(76/314)比44.8%(13/29),χ^(2)=5.877],使用调整的抗血小板聚集治疗方案比例高于发生缺血事件组[49.0%(154/314)比27.6%(8/29),χ^(2)=4.905],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。(3)发生缺血事件的多因素Logistic回归分析显示,吸烟史(OR=2.845,95%CI:1.177~6.874)、颅内动脉粥样硬化(OR=2.615,95%CI:1.131~6.045)、使用编织支架(OR=2.480,95%CI:1.102~5.584)、使用常规抗血小板聚集治疗方案(OR=2.546,95%CI:1.071~6.051)是老年未破裂颅内动脉瘤介入治疗围手术期发生缺血事件的独立危险因素(均P<0.05)。结论 根据CYP2C19基因检测结果调整的抗血小板聚集治疗方案可以降低老年未破裂颅内动脉瘤患者介入治疗围手术期缺血事件的发生风险。本研究结果仍需大样本数据进一步证实。

双酶协同酶解处理对冬枣粉理化特性及结构特征的影响

采用双酶协同酶解工艺对喷雾干燥冬枣粉进行预处理,研究双酶协同酶解处理前后冬枣粉的理化特性及结构特征的变化。结果显示,双酶协同酶解处理后,冬枣粉粒径更小,分布更加均匀,L值增加了0.92%,a值下降了60.22%;b值增加了33.33%;溶解时间、溶解度、溶胀性随粒径的减小显著改善,持水力和持油力显著降低(P<0.05);粉体流动性休止角和滑动角得到显著改善;促进了功能性物质还原糖、多糖、黄酮、总酚的溶出,集粉率和抗氧化性得到显著提高(P<0.05);粉体颗粒表面更加光滑,不易坍塌;红外光谱、X-射线衍射及热重分析结果表明,双酶协同酶解处理未改变冬枣粉分子结构、晶体形式及热稳定性。因此,该研究结果表明双酶协同酶解处理有利于制备高品质冬枣粉,为冬枣粉在食品工业的进一步应用提供一定的参考价值。

双酶协同对烟梗提取物中淀粉降解效应的研究

为有效降解烟梗提取物中的淀粉,利用脉冲安培-离子色谱法研究了α-淀粉酶、α-淀粉酶+糖化酶、α-淀粉酶+普鲁兰酶不同组合体系酶解梗膏中淀粉的效果,并对比了酶解后葡萄糖的生成量,分析了不同酶种类的效果差异。结果表明:单酶体系与双酶体系对于烟梗提取物梗膏中淀粉酶解效果、葡萄糖生成量的影响差异显著。α-淀粉酶+糖化酶、α-淀粉酶+普鲁兰酶双酶体系对淀粉的酶解效果和葡萄糖生成量均优于α-淀粉酶单酶体系。在酶用量方面,当淀粉降解率为50%时,α-淀粉酶+糖化酶体系需要α-淀粉酶365 U/g和糖化酶901 U/g,α-淀粉酶+普鲁兰酶体系需要α-淀粉酶365 U/g和普鲁兰酶815 U/g,而单酶体系需要α-淀粉酶7397 U/g,α-淀粉酶+普鲁兰酶双酶体系酶活单位用量最少;对应使用双酶体系酶解后葡萄糖质量百分数分别增加了6.18%和5.14%,而使用α-淀粉酶单酶体系酶解后,葡萄糖质量百分数仅增加4.71%,即α-淀粉酶+糖化酶体系葡萄糖的生成量最高。

短链脱氢酶Lvchun的分子改造及其在氯霉胺合成中的应用

2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1,3-丙二醇俗称氯霉胺(ANP),由于具有两个手性中心,且结构中的O原子和N原子有良好的配位能力,具有广泛的应用价值。针对化学合成法存在生产成本高、原子经济性低、环保压力大等诸多缺点,旨在通过化学水解法与生物催化法相结合的方式,构建以对硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮(p-NAH)为底物合成(1R)-ANP的新途径。首先采用化学法水解p-NAH制备1-(4-硝基苯基)-2-氨基-3-羟基苯丙酮(AHNA),并筛选对水解产物具有催化活性的羰基还原酶,通过分子改造提高该酶的催化活性,并对突变体mut-V112Y的酶学性质进行研究;然后构建mut-V112Y与甲酸脱氢酶的双酶共表达及融合表达重组菌株,并对重组菌株的催化效率进行比较;最后优化催化反应条件,并进行制备反应。结果表明,化学法可水解p-NAH生成AHNA,筛选到的短链脱氢酶Lvchun可催化AHNA生成(1R)-ANP,通过对该酶进行定点突变获得了催化效率提高3.47倍的突变体mut-V112Y,其最适温度为30℃,最适pH为7.5,具有良好的温度和pH稳定性。成功构建了mut-V112Y和甲酸脱氢酶CbFDH的双酶共表达和融合表达重组菌株,通过比较发现共表达菌株mut-V112Y-CbFDH的催化效率最高。通过优化催化反应条件,最终可在最适条件下反应30 min催化50 mmol/L AHNA生成14.56 mmol/L(1R)-ANP,收率为29.12%。化学水解法与生物催化法相结合的方式可有效地催化p-NAH合成(1R)-ANP,该方法为合成光学纯的ANP提供了新途径。

双酶法辅助提取百香果原花青素及其抗氧化性研究

采用双酶法辅助提取百香果皮中的原花青素,探究反应时间、反应温度、料液比及乙醇体积分数对原花青素提取率的影响。结果表明,果胶酶与纤维素酶之比为7∶3,pH值为4,酶反应温度40℃,催化反应时间0.5 h,提取温度70℃,料液比1∶6.8,乙醇体积分数54%,提取时间1.44 h,原花青素提取率为1.06%,所得原花青素粗提取物对DPPH自由基具有一定的抗氧化活性。

扇贝边酶解技术研究

研究了混合酶水解扇贝边蛋白质的技术条件 ,并和单酶水解情况进行了比较。结果表明 ,混合酶水解可提高水解液中氨基酸态氮 (AAN )含量 ,同时改善了水解液风味。本文引进二次正交旋转组合试验设计方案 ,系统地研究了影响混合酶水解效果的相关因素 ,得出了扇贝边水解液中氨基酸态氮生成量的变化规律—回归模型。应用该模型可对水解液中AAN生成量进行预测 ,也可进一步优化选择扇贝边的酶解条件。

沟垄二元覆盖对渭北旱塬区土壤肥力及玉米产量的影响

探讨沟垄二元覆盖对旱地土壤肥力及作物生产力的影响,对完善半湿润区作物微集水栽培技术具有重要的理论和实践意义。2007—2011年在渭北旱塬进行5年定位试验,设置垄上覆地膜,沟内分别覆普通地膜、生物降解膜、玉米秸秆、液体地膜和沟不覆盖等不同沟垄覆盖模式,以传统平作为对照。结果表明,2011年春玉米收获后各处理土壤有机质及速效养分含量随土层的加深而降低,与2007年试验处理前相比,沟垄二元覆盖各处理土壤养分含量明显增加,而垄覆地膜+沟不覆盖和传统平作处理有所下降。垄覆地膜沟覆秸秆处理0~20 cm层土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量均显著高于对照,垄覆地膜沟覆地膜和垄覆地膜沟覆生物降解膜处理有机质和碱解氮含量较对照有所增加,而其有效磷和速效钾含量显著增加。20~60 cm层土壤有机质和速效养分含量各沟垄二元覆盖处理均略高于对照。各沟垄覆盖处理表层(0~20 cm)土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性均较对照增加,且以垄覆地膜沟覆秸秆处理土壤酶活性最高,垄覆地膜沟覆生物降解膜和垄覆地膜沟覆地膜处理次之。垄覆地膜沟覆生物降解膜、垄覆地膜沟覆地膜和垄覆地膜沟覆秸秆处理较对照显著增产41.1%、42.1%、39.3%,水分利用效率显著提高38.0%、39.6%、37.0%。在渭北旱塬区进行沟垄二元覆盖对提高土壤肥力、酶活性及春玉米产量和水分利用效率有显著提高作用,以垄覆地膜沟覆秸秆处理最佳,垄覆地膜沟覆地膜和垄覆地膜沟覆生物降解膜次之。可见,垄覆地膜沟覆地膜、生物降解膜或秸秆的沟垄全覆盖种植在渭北旱塬雨养农业区春玉米生产栽培具有一定的可行性和应用价值。

双酶水解制备植物蛋白活性多肽工艺优化

以水解度为考察指标,筛选不同酶对蛋白水解,优化双酶水解植物蛋白活性多肽制备工艺.以大豆蛋白和玉米蛋白为主要原料,配制大豆玉米分离蛋白溶液,经预处理后,分别用风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶水解,通过测定水解度,确定用风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶3种酶分别进行双酶水解测定.确定3组双酶水解方案,经过L_(9)(3^(4))正交试验,结果表明双酶水解法可以使水解度有很大提高.最佳水解条件为大豆玉米分离蛋白溶液质量浓度2.09/100mL、风味蛋白酶:复合蛋白酶1:1、pH7.0、水解时间8h,此条件下水解度可以达到75.14%.

双酶分段水解制备燕麦麸蛋白肽工艺优化及抗炎活性研究

建立燕麦麸蛋白双酶分段水解的最佳工艺条件,并初步从细胞水平探究其水解产物的抗炎活性。采用燕麦麸蛋白为原料,以水解度为测定指标,通过单因素结合正交试验优化水解工艺。在最佳工艺条件基础上,采用WST-1法检测细胞增殖,ELISA法检测细胞因子的分泌量。结果发现:在胰蛋白酶添加量7%、pH10、温度50℃、时间4.5 h;碱性蛋白酶添加量11%、pH 9、温度50℃、时间2.5 h的工艺条件下,水解度达到43.62%。在50~200μg/mL范围内,燕麦麸皮肽对LPS诱导的细胞增殖具有抑制作用,能降低胞外促炎性因子IL-1α和IL-6的分泌水平,且呈现量效关系,这表明双酶水解工艺可以显著提高燕麦麸皮肽的水解度,并且水解得到的燕麦麸皮肽具有一定的抗炎活性。

稳定转染纤维素酶相关基因的猪胎儿成纤维细胞系的建立

旨在构建带有双筛选标记的纤维素酶基因的腮腺特异性表达载体,筛选稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系,为制备转纤维素酶基因的转基因克隆猪提供核供体细胞。采用SOE-PCR和PCR方法,分别扩增获得筛选标记基因NEO-T2A-EGFP序列和纤维素酶相关基因的融合序列SP-EGX-F2A-BGL1,构建腮腺特异性表达载体pPSP-SP-EGX-F2A-BGL1-CMV-NEO-T2A-EGFP,经PCR、酶切、测序鉴定正确后,通过脂质体转染猪胎儿成纤维细胞,利用G418抗性和绿色荧光蛋白进行稳定筛选,并利用PCR和Western blot进行检测。结果表明,成功构建了带双筛选标记的腮腺特异表达纤维素酶基因的表达载体,并获得稳定转染该载体的猪胎儿成纤维细胞系。该结果为生产腮腺特异表达纤维素酶的转基因克隆猪研究奠定基础。

紫薯功能饮料双酶水解工艺

采用α-淀粉酶和糖化酶协同水解作用生产紫薯功能饮料,通过单因素试验和正交试验确定紫薯浆的双酶协同水解工艺为α-淀粉酶0.75 g/L,糖化酶1.25 g/L,酶解温度65℃,反应时间70 min,p H值为6.0。此工艺条件下的还原糖值为24.92%,生产的紫薯饮料稳定性好,色泽红艳、口感良好、营养丰富。

超声波辅助双酶法制备黑豆多肽的工艺优化及其抗氧化活性研究

试验以黑豆蛋白为原料,采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合水解黑豆蛋白制备黑豆多肽,同时以超声波辅助水解过程。以蛋白水解度为表征指标进行单因素试验,研究超声功率、复合酶比例、底物浓度、加酶量、反应时间等5种因素对黑豆蛋白水解度的影响,进一步通过正交试验进行黑豆蛋白肽制备工艺的优化。结果显示,超声波辅助复合酶水解黑豆蛋白的最佳工艺参数为:超声功率200 W、酶配比7∶3、反应pH值为7.5、反应温度为52℃、底物浓度5%、加酶量800 U/g、反应时间4 h。黑豆多肽对超氧阴离子自由基(·O_(2)^(-))、羟自由基(OH·)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基(ABTS^(+)·)具有一定的清除能力,具有良好的体外抗氧化活性。

双酶分段水解制备紫花芸豆肽工艺优化及抗氧化测定

研究紫花芸豆蛋白双酶分段水解的最佳工艺及产物的抗氧化特性。以水解度和抗氧化能力为测定指标,筛选酶种类及双酶组合方式,采用正交实验优化双酶分段水解工艺参数,提高紫花芸豆肽的水解度和抗氧化能力。最终确定胰蛋白酶+碱性蛋白酶分段水解为最佳水解工艺,参数为胰蛋白酶添加量7%、pH 10、温度50℃、时间4.5 h;碱性蛋白酶添加量7%、pH 9、温度60℃、时间3 h,水解度达到58.58%;对水解产物进行抗氧化性分析得到:当水解时间分别为6.5 h、7.0 h时,抑制脂质过氧化能力、超氧阴离子清除能力达到最大为46.53%、44.25%。结果均表明胰蛋白酶+碱性蛋白酶双酶分段水解工艺能显著提高紫花芸豆肽的水解度和抗氧化能力。

血管紧张素转化酶和中性肽链内切酶的双重抑制剂

新型血管紧张素转化酶和中性肽链内切酶的双重抑制剂 ,在作用机制上较单纯ACE抑制剂有一定的优越性。它们通过抑制ACE和NEP的活性而发挥降低血压 ,增加体内ANP水平 ,促进尿钠排泄的作用。同时还具有抑制心肌肥厚 ,改善心、肾功能等作用。因此ACE和NEP双重抑制剂为高血压和心衰的治疗开辟了一条新途径。本文简要综述其药理作用机制。

双酶法提取褐蘑菇膳食纤维的最佳工艺条件研究

为了确定从褐蘑菇中提取膳食纤维的工艺参数,采用双酶法提取褐蘑菇膳食纤维,对加酶量、pH值、酶解温度、酶解时间及液料比5个因素进行研究。结果表明:褐蘑菇膳食纤维的最佳提取工艺参数为:加酶量2.1%,酶解温度60℃,酶解时间4.5 h,pH值7.0,料水比1∶10,在此条件下褐蘑菇膳食纤维提取率较高,可达41.37%,且提取的膳食纤维理化性质好。

双酶法辅助制备玉米醇溶蛋白

以玉米蛋白粉为原料,采用双酶法辅助制备玉米醇溶蛋白,先用耐高温α-淀粉酶和糖化酶对原料中的淀粉进行酶解,再用无水乙醇进行脱色脱脂。正交试验结果表明,玉米蛋白粉的最适液化条件为液化温度85℃,p H值6.5,液化时间90 min,α-淀粉酶添加量20U/g;最适糖化条件为糖化温度60℃,pH值5.0,糖化时间120 min,糖化酶添加量300U/g。通过与传统方法比较,原料经过除杂处理后,降低了产品的吸光度,提取率达到25.7%,玉米醇溶蛋白含量达到92.3%。

热处理对β-乳球蛋白酶解效果的影响

采用热处理与前阶段实验摸索出的双酶解反应相结合,两种改性技术联合使用。先通过单因素实验确定热处理的最佳反应时间和反应温度,再进行双酶解反应。以水解度(DH)和可溶性氮含量(TCA-SN)为指标,通过Tricine-SDS-PAGE分析双重处理后水解物的小肽分布情况。结果表明,在85℃,处理20min后再进行双酶解,水解度和可溶性氨基氮含量都得到显著提高,分别达到40%以上,10g/L以上,β-乳球蛋白的残余率低于1%。