TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制

【目的】卵泡抑素(Follistatin)能够调节骨骼肌肥大和脂肪沉积,可促进骨骼肌卫星细胞增殖。拟采用体外重组Follistatin处理增殖期的鸭骨骼肌卫星细胞,阐明TGF-β/Smad信号通路在Follistatin调节鸭骨骼肌卫星细胞增殖过程中的作用机制。【方法】以孵化14 d的鸭胚为试验材料,采用差速贴壁的方法分离骨骼肌卫星细胞,待细胞长到70%—80%时,将培养基换成含有浓度分别为0、1、10、100 ng·m L-1的Follistatin培养基,继续培养36 h后,采用CCK-8检测骨骼肌卫星细胞增殖情况;使用抗pax7抗体染色,DAPI染核,鉴定骨骼肌卫星细胞;采用real-time q PCR方法检测Follistatin对骨骼肌卫星细胞增殖过程中的标记基因PCNA、生肌因子基因Myo D和TGF-β信号通路中TGF-β、Smad2和Smad3的表达的影响。【结果】在倒置显微镜下观察,传代培养12 h鸭骨骼肌细胞一部分未贴壁呈圆形,一部分贴壁呈梭形。24 h后细胞全部贴壁,细胞略有变长。2 d后细胞继续增多,且呈长梭形。3 d后细胞数目增加,个别细胞融合。4 d后细胞数目进一步增加,细胞变粗,个别细胞融合。5 d后有少量细胞开始分化,细胞进一步融合。Pax7免疫荧光染色分析显示,95%以上的细胞中Pax7呈阳性表达;CCK-8检测细胞增殖分析表明,不同浓度的Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞后,各处理组细胞增殖均显著高于对照组(P<0.01),且10 ng·m L-1 Follistatin处理鸭骨骼肌卫星细胞增殖效果最明显,为最佳处理浓度;与对照组相比,10 ng·m L-1 Follistatin处理组的Myo D基因表达量显著下降(P<0.05),PCNA基因表达量显著升高(P<0.05),Myf5基因表达量显著升高,TGF-β和Smad2基因表达显著升高(P<0.05),且Smad3基因表达量极限著升高(P<0.01);Western blotting检测蛋白表达水平结果表明,与对照组相比,TGF-β、Smad2和Smad3磷酸化水平也显著升高。【结论】10 ng·m L-1 Follistatin能显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,这一过程可通过TGF-β/Smad信号通路实现。使用最佳Follistatin处理浓度能够显著促进鸭骨骼肌卫星细胞增殖,该研究为鸭骨骼肌生长发育调控机理研究奠定分子基础。

鸭FST基因编码区克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

本研究旨在获取鸭卵泡抑素(FST)外源蛋白以及进一步深入了解其在肌肉发育和繁殖上的作用,采用RT-PCR方法从鸭卵巢中克隆鸭FST基因CDS序列,并将编码FST成熟蛋白的核酸片段连入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)并采用IPTG进行诱导,诱导后的蛋白经SDS-PAGE分析后用蛋白免疫技术鉴定。序列分析表明,FST基因编码区序列为1 032 bp,编码343个氨基酸,其中信号肽由28个氨基酸组成,成熟蛋白具有4个保守结构域:N-domain、DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ,其中DomainⅠ与鼠DomainⅠ结构较相似,DomainⅡ和DomainⅢ差异很大。SDS-PAGE电泳结果显示表达出的融合蛋白为52 ku,免疫鉴定结果呈阳性。结果表明,FST基因在3个功能结构域上存在差异,推测DomainⅠ主要与其肌肉发育有关,而DomainⅡ、DomainⅢ与鸭繁殖关系密切。本研究成功获取了鸭卵泡抑素蛋白,为进一步研究卵泡抑素在鸭肌肉发育以及繁殖中的功能奠定了基础。