猪链球菌和副猪嗜血杆菌双重Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能够同时检测猪链球菌(SS)和副猪嗜血杆菌(HPS)的方法,本实验根据GenBank中登录的SS gdh和HPS 16S rRNA基因保守序列分别设计并合成引物和探针,经优化反应体系和条件,初步建立了一种可以同时鉴别检测SS和HPS的双重Taq Man荧光定量PCR方法。分别以SS、HPS、支气管败血波氏杆菌(Bb)、金黄色葡萄球菌(SA)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、无乳链球菌(GBS)基因为模板,利用该方法检测,结果显示,除SS、HPS外,与其他猪临床常见病原菌均无交叉反应,特异性强;利用建立的该双重Taq Man荧光定量PCR方法分别对10倍倍比稀释后的SS和HPS质粒标准品以及二者混合菌液检测,结果显示,该方法对SS和HPS质粒标准品的最低检测限分别为7.534×10^(1)拷贝/μL、6.350×10^(1)拷贝/μL,对细菌的最低检测限均为10~2cfu/μL,敏感性较高;组内和组间重复性试验的变异系数均小于3%,表明该方法重复性较好。利用建立的该双重Taq Man荧光定量PCR、常规PCR和国标法对在河南地区不同养猪场收集的54份疑似SS和/或HPS感染的病料样品进行检测,结果显示,双重Taq Man荧光定量PCR和常规PCR检测的阳性率分别为38.89%(21/54)和31.48%(17/54),二者的总符合率为92.59%;国标法与建立的方法检测结果一致。本研究建立的双重Taq Man荧光定量PCR方法为临床SS和HPS的鉴别检测和流行病学调查提供了有力的技术手段。

基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R^(2)均在0.99以上,扩增效率E为88%~90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×10^(2)拷贝/μL和4.09×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%,重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。