松墨天牛dynamin-1-like protein基因的鉴定及表达分析

为了探讨GTP酶超基因家族中dynamin-1-like protein基因在昆虫中的表达特性,以松墨天牛为研究对象,从已构建的cDNA文库中筛选到松墨天牛dynamin-1-like protein基因,命名为Ma DLP1(Gen Bank:KU245763)。该序列长为2 133 bp,编码710个氨基酸。由此预测的蛋白质二级结构主要由α螺旋与无规则卷曲组成,其次是β片层与β转角;Ma DLP1基因编码蛋白质,定位于细胞核。通过DNAMAN软件比对发现Ma DLP1与赤拟谷盗的DLP1同源性最高,为82%,且存在3个保守酶域;用Clustal X和MEGA4.0构建系统发育树,显示松墨天牛与赤拟谷盗处在同一分支。RT-qPCR分析结果显示,Ma DLP1在各虫态不间断表达,幼虫期在5龄幼虫中表达量最高,化蛹期间表达量先上升后下降,羽化期间表达量表现为先上升后下降,并在初羽化的成虫中表达量达到最大值;Ma DLP1在幼虫和成虫头部表达量较高,且在幼虫脂肪体中表达最高;成虫的足、翅、触角和卵巢中也都有表达。说明Ma DLP1的表达与松墨天牛的完全变态发育相关。

糖尿病大鼠海马endophilin-A1和dynamin-1的表达研究

目的研究糖尿病大鼠海马组织endophilin-A1和dynamin-1的表达,以期进一步研究其与糖尿病认知功能损害的关系。方法 14只雄性SD大鼠随机分为两组:正常对照(NC)组和糖尿病(DM)组。腹腔注射链脲佐菌素55mg.kg-1制备糖尿病模型,5周后断头取材,分别进行如下实验:①Western Blot法检测海马组织endophilin-A1和dynamin-1的表达;②免疫组化法观察海马区dynamin-1的表达。用SPSS17.0软件作独立样本t检验。结果①Endophilin-A1和dynamin-1在两组大鼠海马组织中均有表达,其中DM组(0.66±0.12,p=0.004)endophilin-A1的aD值明显低于NC组(0.97±0.07),Dynamin-1在两组中的aD值差别无统计学意义(p=0.841);②免疫组化法显示海马CA3区、DG区dynamin1在各组中均有表达,差异无统计学意义(p=0.114,p=0.783)。结论糖尿病大鼠海马组织endophilin-A1表达下调,而dynamin-1表达未发现明显改变,值得进一步研究以探讨二者与糖尿病突触功能损害的关系。

褐飞虱两个dynamin-1-like基因的克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】研究dynamin-1-like的两个基因NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的生物学功能。【方法】通过聚合酶链式反应扩增褐飞虱dynamin-1-like的两个基因,并对其生物信息学进行分析。通过荧光定量PCR技术(qPCR)检测了这两个基因在褐飞虱不同组织和不同发育阶段中的相对表达量。构建原核表达载体,在表达菌株Rosetta中诱导重组目的蛋白的表达。通过Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,并将纯化得到的蛋白免疫新西兰大白兔,得到多克隆抗体,并用ELISA检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。利用上述抗体,通过免疫荧光实验观察目的蛋白在褐飞虱卵巢中的表达和定位。【结果】克隆并鉴定了两个dynamin-1-like基因,分别命名为NlDNM1L-1和NlDNM1L-2(Gen Bank登录号分别为KY082900、KY082901)。系统进化树表明,NlDNM1L-1和NlD NM1L-2在半翅目昆虫中较为保守。蛋白结构预测和基因时空表达分析说明,NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中可能有着不同的功能。ELISA和Western blotting结果表明,制备的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗体效价高、特异性好。免疫荧光实验结果显示,NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢滤泡细胞中普遍表达,可能与褐飞虱卵巢发育和成熟有关,它们也可能与类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。【结论】获得了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2基因序列,了解了其基本的生物信息,并阐明了其时空表达特征;成功制备其多克隆抗体,并初步了解了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的表达和定位。这些结果为深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的功能奠定了基础。

miR-140在内耳毛细胞中的表达及其对突触蛋白Dynamin-1的调控作用

目的研究miR-140在正常小鼠内耳毛细胞的表达分布及其对编码突触蛋白Dynamin-1的Dnm1基因的靶向调控作用。方法取正常成年C57BL/6小鼠耳蜗基底膜,免疫荧光染色和原位杂交法观察Dynamin-1与miR-140的表达定位情况。构建荧光素酶报告基因载体转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化明确Dnm1是否是miR-140的靶基因。携带miR-140前体及空载的腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)通过圆窗膜注射传递到耳蜗中,14 d后RT-PCR检测miR-140及Dnm1的mRNA表达水平,Western blot检测Dynamin-1蛋白的表达水平。结果 miR-140表达于内外毛细胞细胞质,Dynamin-1主要表达于内毛细胞细胞质;荧光素酶活性检测结果显示,miR-140抑制Dnm1的3'UTR荧光素酶报告基因活性(P<0.05)。RT-PCR及Western blot检测结果显示:转染AAV-miR-140后miR-140的相对表达量明显升高,Dnm1的mRNA及其蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论Dnm1是miR-140的靶基因,且miR-140可以抑制内耳毛细胞中Dynamin-1的表达,表明miR-140可能通过抑制Dynamin-1蛋白负向调控内毛细胞突触囊泡内吞过程,进而影响听觉信号的传递。

菖蒲郁金汤对抽动秽语综合征大鼠突触胞吞相关蛋白表达的影响

目的研究菖蒲郁金汤对抽动秽语综合征模型大鼠神经元胞吞相关蛋白表达的影响。方法大鼠随机分为空白组、模型组、硫必利组及菖蒲郁金汤组。采用腹腔注射亚氨基二丙腈制备抽动秽语综合征模型,连续灌胃给予相应药物4周,在第0、7、14、21、28天,采用刻板行为及运动行为评分法评定行为学变化,Percoll密度梯度离心法制备突触体,RT-qPCR和Western blot法检测突触体中clathrin、AP-2、dynamin-1 mRNA及蛋白表达,免疫组织化学法检测纹状体clathrin、AP-2、dynamin-1蛋白表达。结果与模型组比较,硫必利组和菖蒲郁金汤组行为学评分随时间延长逐渐降低(P<0.05,P<0.01);在给药第28天,菖蒲郁金汤组刻板行为和运动行为评分均低于硫必利组(P<0.01)。与空白组比较,模型组各观察点突触体/纹状体clathrin、AP-2、dynamin-1 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.01);与模型组比较,硫必利组和菖蒲郁金汤组在给药期间突触体/纹状体clathrin、AP-2、dynamin-1 mRNA及蛋白表达随时间延长逐渐降低(P<0.05,P<0.01);在给药第28天,菖蒲郁金汤组突触体clathrin、dynamin-1 mRNA和clathrin蛋白表达低于硫必利组(P<0.05),2组纹状体clathrin、AP-2、dynamin-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论菖蒲郁金汤抗抽动的作用可能是通过调控clathrin、AP-2、dynamin-1的表达来实现。

dynamin-1和磷酸化dynamin-1在内侧颞叶癫癎患儿及大鼠海马组织中的表达

目的观察内侧颞叶癫癎(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)患儿及MTLE大鼠海马组织中dy-namin-1和磷酸化dynamin-1蛋白的表达变化,探讨其在MTLE发生发展中的作用。方法 25日龄Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为急性期对照组、急性期模型组、潜伏期对照组、潜伏期模型组、慢性期对照组、慢性期模型组,应用氯化锂-匹罗卡品诱导建立MTLE动物模型。同时收集接受神经外科手术、并经病理结果确认存在海马硬化的5例患儿的海马组织,及病理科尸检4例对照组海马组织。提取海马组织蛋白,采用Western blot方法和免疫组织化学技术检测总dynamin-1蛋白及磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE患儿及不同时间点MTLE大鼠海马组织中的表达变化。结果 Western blot显示磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期及慢性期表达较同时期对照组显著降低(P<0.05);同时,磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE患儿海马组织表达较对照组显著下降(P<0.05)。而dy-namin-1总蛋白在MTLE大鼠各期、MTLE患儿及对照组海马之间表达无明显差异(P>0.05)。免疫组化结果显示磷酸化dynamin-1在对照组大鼠急性期、慢性期、对照组患儿海马神经元胞浆中高表达,而在同时期MTLE大鼠和MTLE患儿海马神经元胞浆中表达下降(P<0.05)。结论磷酸化dynamin-1而不是dynamin-1总蛋白在MTLE患儿及MTLE大鼠出现癎性发作期间表达下调,其表达变化提示dynamin-1可能通过磷化酸/去磷酸化方式参与MTLE的发生发展。