玉米高蛋氨酸蛋白基因dzs18的克隆及其原核表达载体构建

为将玉米高蛋氨酸蛋白基因在原核细胞中加以表达、培育高蛋氨酸水平的益生菌并用于提高动物饲料的蛋氨酸含量,本研究采用PCR克隆的方法,从玉米自交系B73中克隆出目的基因dzs18。结果表明:目标DNA序列长度729bp;目的基因编码由211个氨基酸组成的富含蛋氨酸的18kDδ-zein,其蛋氨酸残基数(50)占总氨基酸数量的23.7%。该蛋白质氨基酸序列的中部,即第75个氨基酸到第167个氨基酸之间,存在1个由93个氨基酸序列构成的蛋氨酸高密区,蛋氨酸残基数(41)所占比率为44.1%。利用所克隆的B73-dzs18,成功构建出dzs18基因的原核表达载体pGEX4T1-dzs18;目的基因正确插入到载体中GST标签基因的下游;序列测定证明,目的基因dzs18与GST标签基因构成具有无移码突变、连读阅读的GST-dzs18融合基因。

玉米超高蛋氨酸18kD δ-醇溶蛋白基因dzs18克隆及其原核表达

以玉米自交系吉818和富含蛋氨酸（Met）的BSSS53为材料,克隆编码超高蛋氨酸18k Dδ-醇溶蛋白（18kD δ-zein）的dzs18基因,并进行原核表达。结果表明,BSSS53中分离的目标DNA序列,其ORF内有8个碱基替换突变,第208个碱基C发生缺失,导致移码突变、产生截短的多肽链。从吉818中分离的目标DNA长度为741 bp,含有由648 bp构成的ORF,编码由215个氨基酸组成的超高蛋氨酸吉818-18kD-δ-zein。与参考序列相比,目标DNA序列中存在29个碱基替换突变、15个碱基的片段插入和3个碱基的片段缺失。吉818-18kD-δ-zein中Met残基数占27.9%,是10kDδ-zein的2倍,且比参考蛋白多20%,其中部蛋氨酸高密区（HMQR）内Met残基数占50.0%。玉米dzs18在原核细胞中的表达受菌株的影响,在大肠杆菌BL21（DE3）中不表达,在Rossetta（DE3）中正常表达。ITPG浓度在0.1-1.5 mmol/L范围内对目标蛋白的表达量没有明显影响;在1-5 h范围内,目标蛋白量随诱导时间的延长而增加,超过6 h,增加不明显。玉米dzs18基因在Rossetta（DE3）中表达的目标蛋白以包涵体即不溶性蛋白质颗粒形式存在。