多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR检测方法的创新

【目的】创新多重耐药基因lsa(E)实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的检测方法,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供参考。【方法】根据GenBank中lsa(E)基因的参考序列设计特异性引物,通过纯化、连接和转化等步骤,提取含有lsa(E)基因片段的重组质粒DNA为标准品进行检测,绘制标准曲线,验证其特异性和重复性,从而对多重耐药基因lsa(E)qRT-PCR检测方法进行创新;使用该检测方法对牛场粪便、土壤、淤泥和卧料等环境样品中lsa(E)基因的拷贝数量和相对丰度进行检测。【结果】该多重耐药基因lsa(E)qRT-PCR检测方法熔解曲线均为平滑单峰,特异性强;扩增效率良好(101.56%);标准曲线呈现良好的线性关系(r^(2)≥0.997);检测拷贝数量范围广(1.71×10^(2)~1.71×10^(8) copies·μL^(-1))且灵敏度高,组内组间变异系数范围为0.45%~1.66%,重复性强;使用该方法检测牛场环境样品,lsa(E)基因拷贝数量范围为2.54×10^(4)~1.52×10^(8) copies·μL^(-1),相对丰度范围为9.39×10^(-4)~1.20×10^(3),而普通PCR方法仅能在拷贝数量大于1×10^(6) copies·μL^(-1)的环境样品中检测到lsa(E)基因。【结论】本研究创新了多重耐药基因lsa(E)的qRT-PCR检测方法,特异性强,灵敏度高,检测范围广,且能应用于不同养殖环境样品(粪便、土壤和淤泥等)中lsa(E)基因的定量检测,为lsa(E)基因流行和传播的监测提供技术支持和理论指导。

基于e-PCR的小麦、山羊草属SSR电子指纹图谱的开发

电子指纹图谱的绘制可对电泳结果进行规范化、可视化操作,进而提高小麦分子标记的流通性,加速小麦育种进程。本研究用MicroSAtellite(MISA)软件对小麦属、山羊草属共61个叶绿体和13个线粒体的全基因组SSR标记进行搜索,发现SSR位点的出现频率与基因组类型有关,线粒体、叶绿体基因组均以2次重复的五核苷酸和六核苷酸重复基序为主,同一种类型的基序重复次数与SSR数目成反比;基于电子PCR技术(e-PCR)并结合MapChart软件共筛选出30对引物,其中来源于二倍体和四倍体山羊草属叶绿体全基因组的引物分别有16和2对,来源于四倍体和六倍体小麦属叶绿体全基因组的引物分别有5和2对,来源于六倍体小麦属线粒体全基因组的引物有5对,最后用MapChart软件绘制电子指纹图谱。本研究采用了一种新的SSR引物设计和筛选方法,完成了小麦属、山羊草属叶绿体和线粒体共74个全基因组序列SSR分子标记的初步开发和电子指纹图谱的绘制,为引物开发提供了新思路,有利于提高分子标记的流通性以及小麦种质资源亲缘关系的鉴定。

高粱非编码区SSR引物设计以及e-PCR的验证

本研究通过在NCBI公共数据库的高粱全基因序列中进行简单重复序列SSR搜索,结果显示共有87950个SSR位点,共有1134种重复,其中二元碱基和三元碱基重复所占比例最大,分别占43.36%,32.38%。根据SSR搜索结果设计了高粱SSR引物,通过两次e-PCR验证和筛选引物,随机合成了50对引物。以先锋和乐食两个高丹草品种为材料进行引物的筛选和评价。结果表明,50对引物中有46对引物出带,但只有8对引物具有多态性。这说明在高粱非编码区设计的引物多态性并不高于EST-SSR引物,但对高粱的SSR引物的开发可以起到补充和促进作用。

梨火疫细菌实时荧光PCR和诱捕PCR-ELISA检测方法的建立

根据梨火疫细菌中独特而保守存在的质粒pEA2 9,设计了 1对引物和 3条探针 ,建立了实时荧光PCR检测方法和诱捕PCR ELISA检测方法。实时荧光PCR采用带荧光标记的核酸杂交探针 ,边扩增边检测 ,步骤简单 ,不需PCR后处理 ,可避免假阳性和交叉污染 ;诱捕PCR ELISA检测方法只需简单处理的样品就能检测 ,减少了核酸不纯出现的漏检 ,由于增加了核酸杂交探针 ,可不需凝胶电泳EB染色检测 ,不会出现假阳性问题。

大肠杆菌MG1655菌株ERIC-PCR图谱主带序列组成分析

ERIC PCR已经在细菌分类、鉴定及混合菌群分析中得到广泛应用 ,但对其产物形成规律的认识仍存在分歧。以大肠杆菌MG1 655为对象 ,对其ERIC PCR指纹图谱中 1 1kb主带中的DNA片段进行了克隆、测序、基因组定位以及引物匹配分析。结果表明 ,这条1 1kb主带由分布在基因组中不同位置的 3种序列不同的片段组成 ,各片段的丰度差异较大 ,最高为 97 89% ;3种片段中的 2种所在的基因组区域仅一端含有ERIC序列。推测对含有ERIC序列的基因组DNA进行扩增时 ,ERIC PCR是一种非随机扩增。

E.tenella吉林株单卵囊的分离及PCR鉴定

[目的]为了获得E.tenella纯株,进行相关的分子生物学研究。[方法]对已经建立的球虫单卵囊分离技术进行改进,用分离的单卵囊胶囊接种雏鸡。同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定。[结果]20只试验鸡中有15只粪便中分离到卵囊,感染成功率为75%。PCR扩增结果表明该单卵囊分离株为E.tenella。[结论]采用单卵囊胶囊进行接种,操作简便,既节省了接种时间,又降低了接种难度,且大大提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究提供了材料。

用均匀设计优化apoE基因的PCR扩增方案

由于PCR影响因素多 ,获得理想扩增结果比较困难 ,有必要寻找一种简单有效的方法建立最佳扩增体系 .针对Mg2 +浓度、二甲基亚砜 (DMSO)浓度、变性时间、延伸时间、循环次数等因素进行 4因素 6水平和6因素 10水平均匀设计实验优化apoE基因 2 4 4bp片段的PCR扩增条件 .采用纯化模板和简易模板 ,只需 6～10次实验即可获得特异性、高产率扩增结果 .研究表明 ,将均匀设计用于PCR条件优化以及有关的样品处理、试剂选择等研究方面可以避免盲目性 。

应用亚硫酸氢盐修饰后PCR联合TA克隆测序对E-cadherin启动子区甲基化水平的检测

E-cadherin是一种细胞粘附因子,通过增强细胞之间的粘附而起到抑制肿瘤转移的作用.Ecadherin基因启动子区的高甲基化是导致其在众多肿瘤细胞中表达下调甚至缺失的主要原因之一.本实验首先抽提SGC-7901细胞(胃腺癌细胞)、A549细胞(肺腺癌细胞)、MCF-7细胞(乳腺癌细胞)等3个肿瘤细胞株的全基因组DNA,然后对抽提的DNA进行亚硫酸氢盐修饰和纯化回收,根据修饰后的DNA序列设计引物并对其进行PCR扩增.然后将PCR扩增产物与pUC-T TA载体连接并转化入感受态大肠杆菌DH5α中进行培养,对筛选出的含有阳性重组子的菌落进行测序.测序结果显示,3个肿瘤细胞株的E-cadherin基因启动子区的CpG岛都呈现了高度的甲基化,亚硫酸氢盐的修饰效率达到了99.2%.综上研究表明,亚硫酸氢盐修饰后PCR(BSP)联合TA克隆测序可以对肿瘤细胞某基因启动子区CpG岛的甲基化水平进行精确量化,研究所使用的3个肿瘤细胞株均可作为研究肿瘤细胞E-cadherin基因甲基化的细胞模型.

序列特异性引物PCR法检测Rh血型E/e基因型

目的 建立 Rh血型 E/e基因分型的方法 ,以检测人群中 E/e基因频率。 方法 采用快速盐析法抽提样本DNA,采用 PCR-SSP方法检测 E/e基因。 结果 在本研究的 Rh D阳性人群中 E基因频率为 0 .2 2 3 ,e基因频率为 0 .777。Rh D阴性人群中 E基因频率为 0 .0 40 ,e基因频率为 0 .960。 结论 人群中以 e基因为主 ,Rh阳性与阴性人群中 E和 e基因频率存在明显的差异。

子代T4的PCR和realtime PCR测定

目的:为建立通过测定转换样品T4而检验样品大肠杆菌的新方法,探讨快速测定转换样品中T4的PCR技术。方法:以T4 DNA纯化样品水稀释液和转换样品沸水浴处理产物分别为模板样液,经过两对引物PCR及real time PCR的试用和比较,优选定量检测转换样品中T4的适宜方法和条件。结果:源自T4 ligase的一对引物具有较高的灵敏度和特异性;针对纯化T4DNA配制的模板样液,优化的PCR和real time PCR至少可分别精确检出39.25和3.925 pg/ml的T4DNA;针对沸水浴处理转换样品制备的模板样液,PCR和real time PCR可清楚区别不同浓度的转换样品,PCR的检出极限为500 PFU/ml T4的转换样品,real time PCR的检测极限为35 PFU/ml T4的转换样品。结论:采用PCR和real timePCR可快速定量测定转换样品中的T4含量,real time PCR比PCR的灵敏度高约一个数量级。

登革2型病毒E抗原基因的RT-PCR扩增及表达载体的构建

目的扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ法、基因克隆和限制性内切酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区内设计一对ＰＣＲ引物。通过ＲＴ－ＰＣＲ，获得１６００ｂｐＥ抗原编码基因全长ＤＮＡ片段，将其克隆至ｐＫＫ２２３－３质粒的ｔａｃ启动子下游构建成Ｅ抗原表达载体。结论为型特异性Ｅ抗原基因的进一步亚克隆和表达奠定基础；为其他型别登革病毒Ｅ抗原基因的同类研究提供借鉴。

分时同步循环半定量RT—PCR检测胃癌细胞E—钙粘附素表达的方法学建立

目的:探索建立分时同步循环法分管半定量RT-PCR体系,并检测不同分化程度胃癌细胞中E-钙粘附素的相对表达量。方法:以胃癌细胞株HGC-27、MKN45、SCG-790为标本,抽提总RNA,合成第一链cDNA,优化PCR反应条件,建立分时同步循环法分管半定量RT-PCR反应体系,检测比较E-Cad的相对表达量。结果:采用LoTempPCR全息反应液优化,退火温度为85℃,循环数为33,分时同步循环数为8。检测得胃癌细胞的E-Cad表达量与分化程度成负相关,符合试验预期。结论:分时同步循环法分管半定量RT-PCR能克服同管竞争及平台期对试验的影响,理论上减少了试验误差,可以用以胃癌细胞E-Cad表达量的初步检测。

猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其M、N和E基因的序列分析

对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。

泌尿系感染23株大肠埃希菌ERIC—PCR多态性及耐药性分析

目的了解泌尿系统感染大肠埃希菌菌株变异情况及产超广谱p内酰胺酶的耐药情况，指导临床合理用药。方法药敏试验采用K—B法和NCCLS推荐的双纸片协同试验进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检测；23株大肠埃希菌运用ERIC—PCR进行聚类分析，并用聚类统计学软件进行同源性分析。结果23株大肠埃希菌中，检出产ESBLs＋11株，检出率为47.8％；药敏结果显示ESBLs＋菌对20种抗菌药物的耐药率均显著高于ESBLs-菌；聚类分析，将23株大肠埃希菌主要分为四大类，相似系数从0．56～0．92。结论ESBLs＋的大肠埃希菌对头孢噻肟的水解能力很强，大部分ESBLs＋菌株对头孢他啶较稳定；亚胺培南、关洛培南是目前少数对ESBLs＋菌高度稳定的抗生素；应加大对第三代头孢菌素应用的监督，减轻抗生素的选择压力；ERIC—PCR指纹图谱基因技术分型方法分辨率高，重复性好，简便快捷，可用于大肠埃希菌医院感染流行病学监测。

巢式RT-PCR检测E-cad mRNA相对含量的实验条件探讨

目的探讨巢式RT-PCR检测肺组织中E-cad mRNA相对含量的最适实验条件.方法通过改变巢式RT-PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨巢式RT-PCR反应体系最适浓度和反应条件.结果巢式RT-PCR反应体系为dNTP200μmol/L,MgCl21.5mmol/L,引物600nmol/L,Taq DNA聚合酶0.1U/μL,模板50ng,10×反应缓冲液2.5μL,总体系25μL.反应条件为95℃预变性10min,95℃1min、66℃1min、72℃1min,第2次PCR为35个循环,最后72℃延伸10min.结论建立了E-cad mRNA的相对定量检测方法.

颜色补偿实时定量PCR及熔解曲线快速检测载脂蛋白E基因突变

目的探讨应用颜色补偿实时定量PCR及熔解曲线快速检测载脂蛋白E基因两个密码子突变及临床应用价值。方法选取60岁以上老年非酒精性脂肪肝(NAFL)108例和体检正常老年者96例为研究对象。首先以LC-Red640和LC-Red750标记两条针对112和158位编码子的检测探针5′端,相应的锚定探针在3′端被荧光标记,再从人基因组DNA中快速循环PCR特异引物扩增apoE基因265bP片段并与特异探针杂交后,引发荧光共振能量转移,通过异源杂交的出现和错配碱基的类型的熔解参数来完成野生型和突变基因分型。结果峰值对应着序列特异的熔解温度点,各基因型的模板均呈现良好的峰形。NAFL组以杂合子E2/3、E3/4基因型频率最高,与正常组比较差异有显著意义(P【0.05),分布频率为E2/3(35%)、E3/4(25%)、E3/3(35%)、E2/4(2%)、E4/4(2%)、E2/2(1%);NAFL组E4/4频率高于对照组;NAFL组apoE基因总浓度表达水平明显升高(P【0.05)。结论采用PCR结合熔解曲线法进行apoE基因多态性检测,其操作简便省时,不易交叉污染;获得的各种基因类型特征性强,适用于临床快速诊断分型。apoE基因多态性与老年NAFL存在相关性,携带E3/4、E2/3型或E4/4型的个体存在,提示对老年NAFL遗传易感性方面起到重要作用。

载脂蛋白E基因多态性PCR─RFLP方法的建立

目的；建立一种省时，省力的人载脂蛋白Ｅ基因多态性的检测方法。方法；采用聚合酶链一性片段长度多态性方法，先扩增出ａｐｏＥ基因第４外显子内的２７２ｂｐ片段，继以限制性内切酶ＣｆｏⅠ酶解消化，８％聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后银染显带判定基因型。结果：电泳，染色结果清晰特异，分辨率高。结论：该方法快速，准确，适于临床实验室中广泛开展。

FQ-PCR检测小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测小鼠肝癌模型中细胞周期蛋白cyclin E mRNA的方法。方法:以cyclin E和β-actin的PCR产物为阳性模板,分别将二者cDNA产物进行10倍梯度稀释,建立双标准曲线,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测cyclin E和β-actin mRNA含量,对熔解曲线进行分析确定扩增产物的特异性。结果:建立的标准曲线线性关系良好,相关系数r均为-1.00,cyclin E和β-ac-tin扩增效率分别为0.91和0.93,熔解曲线分析显示均为单峰,特异扩增产物的Tm值分别为(81.84±0.28)℃和(89.15±0.26)℃。10-4Cyclin E和β-actin cDNA标本日间变异系数(CV)和批内CV分别为1.02%、1.45%和0.90%、1.48%。结论:SYBR Green I实时荧光PCR定量检测cyclin E mRNA是一种方便快捷、经济实惠、灵敏度高、特异性好的方法,为cyclin E的进一步研究奠定方法学基础。

多重PCR方法快速检测E.coli O_(157)毒力及rfbEO_(157)基因

〔目的〕探索一种快速、特异的检测大肠埃希菌O1 57的多重PCR(multiplexPCR)方法。〔方法〕选用针对大肠埃希菌O1 57志贺样毒素 1、2 (stx1、stx2 )基因、溶血素 (hlyA)基因、粘附抹平因子 (eae)基因和O1 57特异性基因 (rfbEO1 57)的 5对引物 ,在同一扩增体系中进行PCR ,检测 9株不同来源的O1 57和其他大肠埃希菌 2 1株。〔结果〕通过优化多重PCR反应条件和循环参数 ,5对特异性引物只扩增相应的基因片段 ,检测结果与应用常规PCR获得的结果一致。〔结论〕该多重PCR方法能够在一次扩增中同时反应待测菌株是否为大肠埃希菌O1 57及其携带毒力基因的情况 ,可为大肠埃希菌O1 57的诊断及流行病学调查提供一种简便、经济、快速的检测手段。

实时荧光定量PCR检测宫腔脱落细胞中P27^(kip1)及cylin E基因的表达及意义

目的探讨宫腔脱落细胞中P27kip1、cyclin E基因的表达在子宫内膜癌早期诊断中的意义。方法收集健康志愿者及子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞样本共80例;提取总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测目的基因的表达,比较健康志愿者及子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞中P27kip1、cyclin E基因表达量的差异。结果荧光定量PCR结果显示,P27kip1基因在健康志愿者宫腔脱落细胞中的表达显著高于子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P<0.05),并随恶性程度升高,P27kip1的表达水平降低,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);cyclin E基因的表达随恶性程度的增高而增高,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论联合检测P27kip1和cyclin E基因可作为子宫内膜癌早期诊断的依据。