外源报告基因EGFP在盐藻中实现瞬时表达

探索杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的转基因方法和筛选方法 .利用烟草花叶病毒启动子 (CaMV35S)、衣藻叶绿体atpA启动子与来源于水母的加强型绿色荧光蛋白报告基因 (EGFP)构建表达载体pART7GFP和pUCGFP ,转化盐藻 .EGFP在CaMV 35S启动下表达出绿色荧光蛋白 ,在荧光显微镜下看到发绿色荧光的转基因盐藻 .根据荧光数目进行统计 ,转化效率高于 5 % .衣藻来源的启动子atpA在盐藻中未能启动EGFP的表达 .用直径 1μm的金粉颗粒和 0 6 μm的金粉进行基因枪法转化 ,1μm的金粉颗粒成功将外源基因导入盐藻 ,用 0 6 μm的金粉配合多种技术参数也没有将外源基因导入盐藻 .EGFP可以用作盐藻遗传转化的报告基因使单细胞真核生物盐藻可以利用流式细胞术 (FACS)等技术进行筛选 ,从而避开平板筛选转基因盐藻的限制 。

eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。

Egfp标记对菌株降解活性与存活能力影响研究

以蒽为惟一碳源，着重探讨了egfp基因标记对外源降解菌降毹活性和环境竞争能力的影响，研究了石油化工厂污水中存在的混合菌群对外源降解菌的影响。结果表明，egfp基因标记对宿主细胞ETAN1315降解蒽的活性有所降低，但影响甚微，标记菌株仍可用于含蒽废水的处理．EGFP可以作为一种活体指示物，跟踪并实时掌握外源降解菌的生长和运动情况。实验室分离的外源降解菌包括标记的和未标记的，对蒽都具有高效降解活性。与土著混合菌群相比较，外源降解菌显示了环境竞争优势。

稳定表达eGFP-戊型肝炎病毒复制子的建立及体内外特征

戊型肝炎病毒(HEV)是急性病毒性肝炎的主要病原体.为了寻找有效的HEV研究工具,利用反向遗传学构建了携带绿色荧光蛋白(eGFP)的重组HEV感染性克隆——eGFP-HEV.eGFP-HEV转染Huh7.5.1细胞后,在荧光显微镜下能够直接观察到荧光信号,可以实时追踪HEV的复制情况,将eGFP-HEV的子代病毒粒子接种细胞,利用免疫荧光和qRT-PCR验证了其传染性.eGFP-HEV细胞培养系统可以通过直接观察绿色荧光信号来评价药物的抗病毒效果,为HEV药物筛选提供了重要工具.此外,在接种eGFP-HEV的BALB/c裸鼠的胆汁和粪便中也可追踪到eGFP-HEV的绿色荧光信号.值得注意的是,感染小鼠肝脏中表达的HEV抗原量与eGFP的荧光强度高度匹配,可以利用eGFP的荧光信号代表HEV的病毒滴度.携带绿色荧光蛋白的eGFP-HEV感染性克隆在体内、外的成功表达将加快HEV的研究,有利于抗HEV药物或疫苗的研发.