淫羊藿苷基于PLCγ1/AKT/eNOS/NO信号通路改善大鼠少弱精症

目的:探究淫羊藿苷对少弱精症的治疗作用及其作用机制。方法:以奥硝唑(800 mg/kg)所致少弱精症大鼠为动物模型,以淫羊藿苷(50、100 mg/kg)及左卡尼汀(100 mg/kg)干预。称量生殖器官质量,统计实验产仔率,分析附睾精子密度和精子活力;ELISA试剂盒检测血清睾酮含量;苏木精-伊红(HE)观察各组大鼠睾丸组织病理学;免疫荧光染色检测生精小管Sertoli细胞数量;试剂盒测定血清NO含量;Western Blot检测睾丸p-PLCγ1、p-AKT、p-eNOS表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷100 mg/kg组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。结论:淫羊藿苷可以改善少弱精症,其机制可能与PLCγ1/AKT/eNOS/NO通路有关。

eNOS/NO信号通路与心血管疾病关系的研究进展

一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种信号分子,在生理活动中起着重要作用,包括血压调节、血管张力维持、免疫系统调控等,尤其在心血管系统中发挥重要作用。NO产生异常是多种心血管疾病的诱因。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)作为诱导合成NO的限速酶,主要在血管壁的调节中发挥重要作用,因此,其与心血管的正常生理活动密切相关。本文综述了e NOS的基本结构与功能、NO的理化性质,以及e NOS/NO信号通路与心血管系统疾病的关系。

CTRP9通过AdiopR1/AMPK/eNOS/NO信号通路诱导血管舒张

内皮舒张功能障碍与许多心血管疾病关系密切。因此，逆转内皮功能障碍是维持心血管健康的必要手段。脂联素（adiponectin）作为一种脂肪细胞因子，已被证实能改善内皮舒张功能。新近，研究人员发现一个与脂联素同源的脂肪细胞因子蛋白家族一补体Clq／肿瘤坏死因子相关蛋白（CTRPs）。该家族某些成员发挥着与脂联素相似的代谢调节功能，但CTRPs的血管调节功能尚不清楚。

秋水仙碱通过激动PI3K/AKT/eNOS信号通路对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的:探究秋水仙碱通过调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能的影响。方法:78只大鼠中随机选取12只作为假手术组,剩余大鼠构建AMI模型,造模成功大鼠分为模型组、秋水仙碱组[4 mg/(kg·d)]、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+LY294002(20 mg/mL)组、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+MK-2206(60μg/mL)组、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+L-NAME(1.6 mg/mL)组,每组12只。超声心动图检测大鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、射血分数(EF)及短轴缩短率(FS)。处死大鼠,苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠心肌组织石蜡切片病理学变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡率;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)水平;免疫印迹法(Western Blot)测定大鼠心肌组织PI3K/AKT/eNOS通路蛋白表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT、磷酸化eNOS(p-eNOS)/eNOS降低(P<0.05);与模型组相比,秋水仙碱组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率降低,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高(P<0.05);与秋水仙碱组相比,秋水仙碱+LY294002组、秋水仙碱+MK-2206组、秋水仙碱+L-NAME组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低(P<0.05)。结论:秋水仙碱可能通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路对AMI大鼠发挥心功能保护作用。

替格瑞洛通过akt/AMPK/eNOS信号通路调节AMI后小鼠血管新生及其机制研究

目的 探究替格瑞洛通过akt/AMPK/eNOS通路调节腺苷浓度,进而促进急性心肌梗死(AMI)后血管新生的作用,并探讨其潜在机制。方法 采用冠脉结扎法建立AMI的小鼠模型,使用替格瑞洛灌胃处理建立实验组,通过akt抑制剂Perifosine、AMPK抑制剂Dorsomorphin和腺苷受体抑制剂MRS1523建立对应蛋白抑制的模型,采用HE染色、Masson染色评估心肌损害情况,采用免疫组化、rt-PCR、Western blot检测VEGF蛋白水平和mRNA水平表达情况,采用酶标法检测AMI小鼠体内腺苷表达情况,随后采用Western blot检测akt/AMPK/eNOS通路蛋白及其磷酸化形式的表达情况。结果 替格瑞洛可明显上调p-akt/akt和p-eNOS/eNOS比值,下降p-AMPK/AMPK比值,并增加AMI后小鼠体内腺苷水平,进而促进心肌梗死后局部心肌细胞内VEGF蛋白水平和mRNA水平表达。结论 替格瑞洛可通过活化akt/AMPK/eNOS系统来调节AMI后小鼠体内腺苷浓度,进而促进局部心肌细胞内VEGF蛋白水平和mRNA水平表达。

“调神畅志”法针刺对帕金森伴便秘模型大鼠结肠组织PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

目的:探讨“调神畅志”针法对帕金森(PD)伴便秘大鼠结肠组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/AKT/eNOS)信号通路关键标志物(PI3K、AKT、p-Akt及eNOS)的影响,并探究此针法治疗的机制。方法:采用颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制造PD伴便秘大鼠模型,并用APO诱导检测。40只造模成功大鼠随机分为模型组、西药组、常规针刺组与调神畅志组,每组10只,另空白组、假手术组各10只,共计60只,予相应干预4周。采用Western blot法检测各组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT、p-Akt蛋白表达和eNOS含量。结果:与空白组相比,模型组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达显著降低,eNOS含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,西药组、常规针刺组和调神畅志组远端结肠组织PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达均明显升高,eNOS含量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与常规针刺组比较,调神畅志组PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达明显较高,eNOS含量显著较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:针刺能够改善PD伴便秘大鼠模型便秘症状,且调神畅志针刺优于常规针刺,PI3K/AKT/eNOS信号通路的激活是调神畅志针法的治疗机制之一,其作用机制是通过上调大鼠远端结肠组织中PI3K/AKT/eNOS信号通路中PI3K、AKT、p-Akt的蛋白表达和降低eNOS含量来实现的。

瓜蒌皮水提物通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制缺血缺氧大鼠原代心肌细胞的凋亡

以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路、抑制心肌细胞凋亡为切入点,探究瓜蒌皮水提物(TP-W)保护心肌缺血的机制.分离大鼠心肌细胞,通过缺氧气体+无血清培养液培养制造缺血缺氧损伤模型,以模拟急性心肌缺血时的体内心肌细胞环境;同时添加PI3K特异性抑制剂(LY294002)和TP-W处理细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑兰法、末端标记法分别检测细胞存活率及凋亡率,免疫荧光联合免疫印迹方法定位、定量地检测细胞内PI3K、Akt及eNOS蛋白表达及磷酸化水平.结果显示:对上述缺血缺氧损伤的心肌细胞,TP-W可显著改善其生长状态、提高存活率、降低凋亡率;同时显著上调上述3种蛋白表达水平及磷酸化水平,但磷酸化水平均可被LY294002处理显著削弱.可见,激活PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制心肌细胞凋亡可能是TP-W抗心肌缺血的重要机制,也是中药“开胸除痹”的关键生物学内涵.

益景汤经PI3K/AKT/eNOS信号通路拮抗高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤

目的探讨益景汤对高糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞损伤的拮抗作用及机制。方法将大鼠视网膜微血管内皮细胞随机分为5组:对照组(CG)、高糖组(HG)、低浓度益景汤组(LYG)、中浓度益景汤组(MYG)、高浓度益景汤组(HYG)。细胞生长至80%~90%时,往高糖组及益景汤组培养基中加入33 mmol/L葡萄糖培养3 d造高糖内皮细胞损伤模型,第4天按分组加入相应正常糖培养基及各浓度益景汤培养24 h。使用CCK-8试剂盒检测内皮细胞活性,Transwell法观察内皮细胞迁移,荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1及内皮细胞磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的信使RNA(mRNA)表达。结果高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞活性均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞迁移均低于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均降低,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论益景汤能经PI3K/AKT/eNOS信号通路抑制高糖诱导视网膜微血管内皮细胞迁移,提高细胞活性,减轻细胞损伤。

蛇床子素对大鼠信号通路AKT/eNOS/sGC/PKG及成骨细胞成熟分化的影响

目的研究蛇床子素(osthol)是否通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)/可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)/蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信号通路促进大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)矿化成熟。方法检测蛇床子素处理ROBs后,成骨性转录因子RUNX2、OSX以及AKT/eNOS/sGC/PKG信号途径蛋白表达水平、免疫荧光法观察信号通路下游蛋白核易位;检测碱性磷酸酶(alkline phosphatase,ALP)活性;用AKT特异性抑制剂MK-2206阻断AKT功能后,检测MK-2206对AKT/eNOS/sGC/PKG信号途径活性及对ROBs矿化成熟的影响,进一步评估蛇床子素促进成骨细胞矿化成熟的潜在机制。结果蛇床子素处理ROBs后,成骨性转录因子RUNX2、OSX蛋白及AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路蛋白表达量均增加,ALP活性上升;加入AKT抑制剂后,蛇床子素不再激活AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路,阻断了蛇床子素促进ROBs的矿化成熟。结论蛇床子素可通过激活AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路促进成骨细胞矿化成熟。

基于VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨木犀草素干预A型流感病毒的作用机制

目的探讨木犀草素对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染的小鼠肺上皮细胞损伤模型的作用机制。方法将小鼠肺上皮MLE-12细胞分为正常组、模型组、奥司他韦组、高剂量组和低剂量组,除正常组外,其余4组均使用IAV感染,正常组加入等量病毒稀释液;2 h后弃病毒工作液,正常组和模型组加入病毒维持液,药物组加入用病毒维持液稀释的药物工作液,干预8 h后收集细胞。使用CCK-8检测细胞增殖情况;ELISA实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光检测细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测细胞内VEGF、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达情况;Western blot法检测细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示,不同浓度的木犀草素均能降低IAV感染所致的细胞损伤(P<0.01),其EC50值为7.204μmol/L,因此,将后续实验中的木犀草素药物浓度定为5μmol/L和2.5μmol/L。与正常组相比,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-6升高(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度增强(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组和低剂量组细胞上清液中TNF-α和IL-6降低(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度减弱(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.01)。结论木犀草素能抑制炎性细胞因子的分泌,缓解IAV感染所致的细胞损伤,其过程可能与VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

黄芩苷对多杀性巴氏杆菌感染猪巨噬细胞后炎症因子表达及信号通路影响的研究

为研究不同浓度黄芩苷对多杀性巴氏杆菌(Pm)HN-13株感染的猪巨噬细胞(HD11)内炎症因子表达的影响及与炎症信号通路的相互作用关系,本研究采用western blot检测HN-13株感染(0、30 min、60 min、90 min)HD11细胞中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路3个关键蛋白(p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK)的表达水平;采用ELISA和荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)分析检测低浓度剂量黄芩苷(L组,20μmol/L)、中浓度剂量黄芩苷(M组,40μmol/L)和高浓度剂量黄芩苷(H组,60μmol/L)对Pm感染的猪巨噬细胞内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β分泌水平及其m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)和模型组(HN-13);利用抑制剂SCH772984阻断ERK通路,采用ELISA和RT-qPCR检测黄岑苷对Pm感染的HD11细胞内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达及m RNA转录水平的影响,同时设置对照组(Control)、模型组(HN-13)、抑制组(HN-13+抑制剂)。结果显示:与HN-13株处理0 min组相比,随着感染时间的延长,HN-13株感染HD11细胞中p-ERK/ERK的蛋白表达量逐渐升高(P<0.01),而p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达量均未发生显著变化(P>0.05),表明,HN-13株可使HD11细胞炎症相关ERK通路蛋白表达增强,且与作用时间呈正相关。与模型组(HN-13)相比,3个浓度剂量的黄芩苷均显著抑制TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平及m RNA转录水平(P<0.05),且抑制作用随着黄芩苷浓度升高而增强。与抑制组相比,黄芩苷与抑制剂共处理组可以显著抑制HN-13感染的HD11细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及m RNA转录水平(P<0.05)。综上所述,黄芩苷可以抑制Pm感染的HD11细胞中ERK通路相关蛋白的表达和分泌,进而发挥抗炎作用。本研究为研制防治Pm引起的猪肺疫的新药提供了思路。

基于eNOS/NO信号通路探讨脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠的作用

目的:基于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)/一氧化氮(nitric oxide,NO)信号通路探讨脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠的降压作用及机制。方法:随机从70只6周龄SPF级雄性SD大鼠中选取10只为正常组,其余60只大鼠采用皮下注射环孢菌素A加灌胃给予附子和高脂乳剂制备肝热痰瘀证高血压大鼠模型。取造模成功的大鼠50只,随机分为模型组、卡托普利组及脑清通颗粒低(1.3 g·kg^(-1))、中(2.6 g·kg^(-1))、高(5.2 g·kg^(-1))剂量组,每组10只,于造模成功的第2天开始给予相应药物灌胃,正常组和模型组灌胃给予等体积生理盐水,每日1次,连续21 d。分别于造模前、造模第7天、造模第14天、给药第7天、给药第14天和给药第21天测量大鼠尾动脉压,计算平均动脉压(mean arterial pressure,MAP);HE染色观察血管内膜形态学变化;ELISA检测血清血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、eNOS、NO含量;免疫组化和Western Blot检测胸主动脉组织中eNOS蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组MAP及血清ET-1、AngⅡ水平明显升高,血清NO、eNOS水平及胸主动脉eNOS蛋白表达水平显著降低;与模型组比较,脑清通颗粒各剂量组血清ET-1、AngⅡ水平显著降低,NO、eNOS水平显著升高,胸主动脉eNOS蛋白表达水平显著升高,给药14 d后MAP显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示,模型组大鼠血管内膜粗糙,结构不完整,有明显脱落现象,平滑肌细胞数量明显减少,而脑清通颗粒各剂量组大鼠血管内膜损伤均得到了不同程度的改善。结论:脑清通颗粒能改善肝热痰瘀证高血压模型大鼠血管内膜损伤,降低血压,其机制可能与抑制ET-1和AngⅡ的释放,激活eNOS/NO信号通路有关。

软骨细胞中SIRT1基因敲减后作用状态不明确信号通路及对相关疾病或功能的影响

背景:沉默信息调节因子1以去乙酰化的方式调控软骨细胞中相关蛋白的功能,参与软骨细胞增殖分化,促进软骨缺损修复。目的:利用高通量技术筛选软骨细胞中沉默信息调节因子1基因敲减后作用状态不明确的信号通路以及产生变化的疾病或功能。方法:取处于对数生长期的小鼠ATDC5软骨细胞,分2组转染:对照组转染沉默信息调节因子1基因敲减阴性对照慢病毒,实验组转染沉默信息调节因子1基因敲减慢病毒。转染72 h后,利用小鼠基因表达谱芯片GeneChip®Mouse Genome 4302.0 Array检测mRNA的基因层面变化情况,应用生物信息学技术筛选激活或抑制不明确的信号通路以及这些信号通路相关因子,并分析疾病或功能模块的富集情况。结果与结论:①沉默信息调节因子1基因敲减后,小鼠ATDC5软骨细胞中激活或抑制状态不明确的信号通路有245条;②根据-log(P-value)排序选择排前20的激活或抑制状态不明确信号通路中的因子情况进行报道,包括IGFBP4、TGFBR1、CTGF、COL4A5、LHX2、IL1RL1、KLF6等;③根据-log(P-value)进行排序,细胞生长和增殖、生物体存活和细胞死亡与存活等14个疾病和功能密切相关模块明显变化;根据差异基因数量排序,生物体损伤和异常、癌症和细胞死亡与存活3个疾病和功能密切相关模块明显变化;根据-log(P-value)与差异基因数量综合排序,固有免疫应答这一疾病和功能模块被显著激活。

miR-375-3p过表达调控Akt-eNOS信号通路促进心肌梗死大鼠心肌修复作用机制

目的探究miR-375-3p过表达调控丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路促进心肌梗死(MI)大鼠心肌修复作用的机制。方法将大鼠分为假手术(sham)组、MI组、阴性对照(NC)组、miR-375-3p组,各10只。比较各组miR-375-3p相对表达、心功能指标[左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)]、心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(cTnT)I、脑钠肽前体(Pro-BNP)]、心肌梗死面积、心肌组织病理学变化及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达。结果与sham组比较,MI组、NC组miR-375-3p表达显著降低;miR-375-3p组miR-375-3p表达显著高于sham组及MI组(P<0.05)。与sham组比较,MI组、NC组及miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著升高,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著降低,MI面积显著增加(P<0.05)。与MI组比较,miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著降低,MI面积显著减少,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论miR-375-3p过表达可激活Akt-eNOS信号通路促进MI大鼠心肌修复。

Notch信号通路在成人EB病毒感染所致传染性单核细胞增多症中的作用

目的:观察成人传染性单核细胞增多症(IM)患者Notch信号通路分子和Th22细胞的变化,检测抑制Notch信号通路对Th22细胞的调控作用。方法:纳入42例IM患者和21例健康对照者,采集外周血,分离血浆和外周血单个核细胞,酶联免疫吸附试验检测血浆白细胞介素(IL)-17和IL-22水平,流式细胞术检测CD3+CD4+IL-17+Th17细胞和CD3+CD4+IL-22+Th22细胞比例,实时定量PCR法检测Th17转录因子维甲酸相关孤独核受体γt(RORγt)、Th22转录因子芳香烃受体(AhR)及Notch信号通路分子(包括Notch受体、Notch配体、Notch下游分子)mRNA相对表达量。纯化CD4+T细胞,使用γ-分泌酶抑制剂(GSI)刺激培养,检测GSI刺激后细胞增殖、Th17和Th22细胞比例、IL-17和IL-22分泌、转录因子mRNA相对表达量变化。结果:IM组外周血单个核细胞中Notch1和Notch2 mRNA的相对表达量分别为13.58±3.18、4.73±1.16,均明显高于对照组的1.09±0.12、1.07±0.15(均P<0.001),而Notch3和Notch4 mRNA相对表达量在IM组和对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。IM组Notch配体DLL1和Jagged1 mRNA相对表达量、Notch信号下游分子Hes1、Hes5和Hey1 mRNA相对表达量均高于对照组(均P<0.001)。IM患者Th17和Th22细胞比例分别为5.03%±1.15%、4.48%±1.29%,均高于对照组的4.36%±0.82%、3.83%±0.55%(均P<0.05);血浆IL-17和IL-22水平分别为(301.1±53.82)pg/ml、(101.2±16.45)pg/ml,均高于对照组的(237.2±72.18)pg/ml、(84.75±11.83)pg/ml(均P<0.001);RORγt和AhR mRNA相对表达量分别为1.25±0.22、1.21±0.12,均高于对照组的0.99±0.15、1.04±0.11(均P<0.001)。CD4+T细胞增殖水平、Th17细胞比例、IL-17分泌和RORγt mRNA相对表达量在无GSI刺激组和经GSI刺激组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。经GSI刺激后Th22细胞比例、IL-22分泌和AhR mRNA相对表达量较无GSI刺激降低(均P<0.05)。结论:Notch信号通路通过AhR调控IM患者CD4+T细胞分泌IL-22,Notch-AhR-Th22细胞通路可能参与IM发病。

金雀异黄素通过调控TGF-β1/Smad3信号通路对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨金雀异黄素减轻糖尿病大鼠心肌纤维化的作用及潜在机制。方法 通过高脂饮食结合腹腔注射链脲菌素(STZ)法建立大鼠2型糖尿病(T2DM)模型,并随机分为模型组、二甲双胍组(100 mg/kg)及金雀异黄素低、高剂量组(50、100 mg/kg),另设正常组给予常规饮食,每组10只。各给药组灌胃给药8周,检测体质量、心功能、心脏质量及心脏指数,血清CK-MB、AST及LDH活性,观察心肌纤维化程度,心肌组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源物3(Smad3)mRNA和蛋白表达,心肌组织Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)蛋白分布及表达。结果 与模型组比较,金雀异黄素各剂量组大鼠体质量、每搏输出量(SV)及射血分数(EF)升高(P<0.01),心脏指数、左心室收缩末期内径(LVIDs)、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织胶原相对面积及CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),金雀异黄素高剂量组左心室舒张末期内径(LVIDd)降低(P<0.05)。结论 金雀异黄素可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,减轻2型糖尿病大鼠心肌纤维化作用,进而发挥保护心脏效应。

WNK2通过抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路延缓肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨WNK2对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma,HCC)中ERK1/2/ROS/SHP2信号通路的影响,并探讨其在HCC细胞增殖和迁移中的作用。方法将WNK2-mimic和sh-RNA WNK2以及相应的阴性对照转染HepG2细胞,采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测WNK2对肝细胞癌增殖能力的影响;采用Western Blot检测瘤组织中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用SHP2抑制剂PHPS1进行处理之后,采用Western Blot检测HepG2细胞中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用细胞划痕实验和Transwell检测HepG2细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和CCK-8检测HepG2细胞的增殖能力。结果与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组裸鼠的瘤体体积显著增大(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组裸鼠的瘤体体积显著减小(P<0.01);Western Blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组WNK2的表达显著升高(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.01);在体外实验当中,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);相对于sh-NC+PHPS1组,sh-RNA WNK2+PHPS1组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),而p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达则被逆转并且与sh-NC+PHPS1组不具有显著性差异(P>0.05);细胞划痕实验和Transwell结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P<0.01);sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05);单克隆增殖实验结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的增殖能力显著升高(P<0.01),而sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05)。结论WNK2可以抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路,从而抑制ERK1/2/AKT信号通路,延缓HCC的增殖和迁移。

萝卜硫素通过调节ALOX5/NF-κB信号通路调控巨噬细胞糖酵解抑制糖尿病肾病进展

目的探讨萝卜硫素(SFN)调节花生四烯酸5-脂氧合酶基因(arachidonic acid 5-lipoxygenase,ALOX5)/核因子kappa B(NF-κB)信号通路调节巨噬细胞糖酵解对糖尿病肾病(DN)进展的影响。方法生物信息学分析SFN治疗DN的靶基因。使用30 mmol/L高葡萄糖(HG)处理人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)诱导体外DN模型。将HK-2细胞分为如下组:正常糖(NG)组、HG组、HG+SFN(3 mmol/L)组、HG+ALOX5组、HG+SFN(3 mmol/L)+ALOX5组、HG处理的巨噬细胞+HK-2细胞组、HG+SFN(3 mmol/L)处理的巨噬细胞+HK-2细胞组、HG+ALOX5转染处理的巨噬细胞+HK-2细胞组、HG+SFN(3 mmol/L)+ALOX5转染处理的巨噬细胞+HK-2细胞组。CCK-8检测细胞活力,原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;葡萄糖和乳酸试剂盒检测各组细胞中葡萄糖和乳酸水平;Western blot检测各组细胞中ALOX5、NF-κB以及糖酵解相关蛋白己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达;使用链脲佐菌素(STZ)构建DN小鼠模型,DN小鼠给与SFN(0.5 mg/kg)治疗;检测小鼠各项生化指标,HE染色检测肾组织病理变化;Western blot检测小鼠肾脏巨噬细胞中糖酵解相关蛋白己糖激酶-2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达。结果生物信息学分析结果显示ALOX5是SFN治疗DN的靶基因。与HG组相比,SFN处理增强HK-2细胞活力并抑制细胞凋亡(P<0.05);同时,SFN处理抑制HG诱导的巨噬细胞糖酵解相关蛋白的表达,减弱巨噬细胞介导的HK-2细胞损伤(P<0.05);Western blot结果表明SFN抑制ALOX5和NF-κB的表达(P<0.05);小鼠实验结果显示,SFN治疗改善DN小鼠肾功能和肾组织病理学改变,抑制肾组织中巨噬细胞糖酵解相关蛋白的表达(P<0.05)。结论SFN通过抑制ALOX5/NF-κB信号通路抑制巨噬细胞糖酵解从而改善DN进展。

水苏碱调节Hippo-YAP信号通路对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用

目的探究水苏碱(stachydrine,STA)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)新生大鼠的神经保护作用,并分析其作用机制。方法将新生SD大鼠随机分为假手术组、HIBD组、STA低剂量(5 mg/kg)组、STA中剂量(10 mg/kg)组、STA高剂量(20 mg/kg)组、维替泊芬(10 mg/kg)+STA高剂量(20 mg/kg)组,除假手术组外,其余大鼠构建HIBD大鼠模型。对各组大鼠进行神经功能缺损评分,采用Morris水迷宫实验进行认知功能评价,测定各组大鼠脑含水量和脑指数,HE染色、尼氏染色观察脑组织神经元损伤,TUNEL染色观察脑组织神经元细胞凋亡情况,Western blot法检测YES相关蛋白(YES associated protein,YAP)、p-YAP、哺乳动物STE20样蛋白激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、p-MST1、具有PDZ基序的转录共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)蛋白表达。结果与假手术组比较,HIBD组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05);与HIBD组相比,STA低、中、高剂量组海马组织损伤改善,尼氏小体增加(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著降低(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著增加(P<0.05);与STA高剂量组相比,维替泊芬+STA高剂量组海马组织损伤加重,尼氏小体减少(P<0.05),神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织含水量、脑指数、神经元细胞凋亡率、p-YAP/YAP比值、p-MST1/MST1比值显著增加(P<0.05),穿越平台次数、TAZ表达显著降低(P<0.05)。结论STA可能通过调控Hippo-YAP信号通路、减少神经损伤和神经元细胞凋亡、改善神经功能,发挥对HIBD新生大鼠的神经保护作用。

川芎嗪调控Wnt/β-连环蛋白信号通路对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的机制研究

目的:探讨川芎嗪调控Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对冠心病(CHD)大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:选择成年雄性SD大鼠50只,分为对照组、模型组、川芎嗪低、中、高剂量组,各10只。采用高脂饲料喂养加脂肪乳剂灌胃建立CHD大鼠模型,对照组和模型组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水,川芎嗪低、中、高剂量腹腔注射川芎嗪,各组均连续治疗3周。干预后检测各组大鼠心功能和血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,采用HE染色观察心肌组织结构,TUNEL检测心肌细胞凋亡情况,RT-qPCR、Western blot法检测心肌组织Wnt3a、β-cateninmRNA及蛋白表达。结果:模型组大鼠心功能低于对照组和川芎嗪低、中、高剂量组(均P<0.05)。模型组大鼠血清LDH、CK、CK-MB水平高于对照组和川芎嗪低、中、高剂量组(均P<0.05)。对照组心肌细胞大小均等,心肌纤维无肿胀、排列紧密,模型组心肌纤维呈现明显肿胀、断裂,细胞排列无规则,并有大量炎症细胞浸润,川芎嗪低、中、高剂量组心肌损伤逐渐改善,细胞水肿变性减少,仅少量炎性细胞浸润。川芎嗪高剂量组心肌组织中Wnt3a、β-cateninmRNA和蛋白表达低于低、中剂量组(均P<0.05)。结论:川芎嗪能改善大鼠心肌细胞的凋亡,减轻细胞损伤,其机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达有关。