lncRNA-MIAT通过靶向调控miR-584/EZH2轴促进DLBCL细胞的自噬

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)-MIAT通过调控微小RNA(miR)-584/ZESTE同源物增强子2(EZH2)轴对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞自噬的影响。方法将DLBCL细胞系Raji分为siMIAT组[lncRNA-MIAT的小干扰RNA(siRNA)构建沉默组]、沉默阴性对照组(siNC组)、miR-584的模拟物组(mimic组)、模拟物阴性对照组(mimic-NC组)。将siMIAT组的Raji继续分为miR-584的inhibitor组(inhibitor组)、inhibitor的阴性对照组(inhibitor-NC组)、EZH2过表达组(pcDNA-EZH2组)以及过表达空载体组(pcDNA-null组)。用实时定量PCR法(qRT-PCR)检测lncRNA-MIAT和miR-584的表达,用荧光原位杂交(FISH)实验检测lncRNA-MIAT在Raji中的定位。用Western blot法检测EZH2和细胞自噬标志物LC3-I、LC3-II、Atg5、Beclin-1和p62的表达。CCK-8法检测细胞的增殖活性。用双荧光素酶报告基因分析miR-584与EZH2的靶向调控作用以及miR-584与lncRNA-MIAT的靶向调控作用。结果与B淋巴细胞系MAO比,lncRNA-MIAT在Raji中高表达(P<0.05),lncRNA-MIAT的表达主要定位在MAO和Raji的细胞质中。沉默lncRNA-MIAT抑制细胞的增殖活性并抑制细胞的自噬(均P<0.05),沉默lncRNA-MIAT还抑制EZH2的表达并促进miR-584的表达(均P<0.05)。生信分析预测lncRNA-MIAT与miR-584具有多个结合位点,以及EZH2与miR-584也具有多个结合位点,双荧光素酶报告基因实验证实EZH2是miR-584的靶基因,且miR-584与lncRNA-MIAT也具有靶向调控作用。在沉默lncRNA-MIAT的细胞中,与inhibitor-NC组比,inhibitor组中细胞的增殖活性以及细胞的自噬均增加(P<0.05)。在沉默lncRNA-MIAT的细胞中,与pcDNA-null组比,pcDNA-EZH2组中细胞的增殖活性以及细胞的自噬均增加(P<0.05)。结论lncRNA-MIAT通过靶向调控miR-584/EZH2轴促进DLBCL的增殖,增强DLBCL细胞的自噬。

急性缺血性脑卒中患者血清长链非编码RNA母系表达基因3和Zeste同源物增强子-2表达与神经功能损伤的相关性分析

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)母系表达基因3(MEG3)与Zeste同源物增强子-2(EZH2)在急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清中的表达水平及其与神经功能损伤之间的关系。方法选取延安市人民医院2021年1月至2022年11月收治的92例AIS患者为脑卒中组,92例健康体检者为对照组,根据NIHSS评分将脑卒中组患者分为致残性损伤组19例,非致残性损伤组73例。采用实时荧光定量聚合酶链式反应、酶联免疫吸附法分别检测血清lncRNAMEG3、EZH2水平。采用Spearman相关分析法进行AIS患者血清lncRNAMEG3、EZH2表达水平与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分之间的相关性分析;采用多因素Logistic回归分析AIS患者合并神经功能致残性损伤的影响因素,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA MEG3、EZH2水平对AIS患者合并神经功能致残性损伤的诊断价值。结果脑卒中组患者血清lncRNA MEG3、EZH2表达水平均高于对照组(t=11.817、11.542,P<0.05)。Spearman相关分析显示,AIS患者血清lncRNA MEG3、EZH2水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.540、0.603,P<0.01)。致残性损伤组体质量指数、吸烟史占比、甘油三酯、总胆固醇、同型半胱氨酸、发病-到院时间(ODT)、lncRNAMEG3、EZH2水平均高于非致残性损伤组(t/χ2=2.103、5.050、9.121、5.585、2.276、5.448、4.638、4.682,P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,甘油三酯、总胆固醇、lncRNA MEG3、EZH2以及ODT均是AIS患者合并神经功能致残性损伤的影响因素(OR=4.853、4.277、2.674、3.052、3.901,P<0.05)。lncRNA MEG3、EZH2联合诊断AIS患者合并神经功能致残性损伤的曲线下面积(AUC)大于lncRNAMEG3以及EZH2单独诊断的AUC(Z=2.626、2.954,P<0.01),敏感度、特异度分别为94.74%、82.15%。结论AIS患者血清lncRNA MEG3、EZH2水平均上升,与AIS患者神经功能损伤程度均正相关,可用作AIS患者合并神经功能致残性损伤的诊断指标,且联合诊断效果更好。

缺血性疾病患者血清lncRNA PVT1和FOXM1表达水平及联合心脏磁共振延迟强化成像与预后的关系

目的 探讨缺血性疾病患者血清长链非编码RNA浆细胞瘤转化迁移基因1(lncRNA PVT1)和叉头框转录因子M1(FOX M1)表达水平及联合心脏钆对比剂延迟增强磁共振成像(LGE-MRI)与预后的关系。方法 选取2021年2月-2022年2月我院收治的缺血性心脏病患者118例即为研究组,随访一年根据随访过程中是否发生主要心脏不良事件(MACE),分为MACE组32例,无MACE组86例。同期选择在我院体检健康的志愿者118例为对照组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清lncRNA PVT1的相对表达量。采用酶联免疫吸附试验(E LISA)检测FOXM1水平。受试者工作特征(ROC)曲线分析LGE-MRI、血清lncRNA PVT1和FOXM1对缺血性心脏病患者预后发生MACE的预测价值。结果 研究组患者DBP、SBP、TG、TC、 LDL-C、GLU水平与对照组相比显著升高,HDL-C水平显著降低(P<0.05)。与对照组相比,研究组的血清中lncRNA PVT1和FOXM1水平显著升高(P<0.05)。与无MACE组相比,MACE组患者DBP、SBP、TC、LDL-C水平显著升高, HDL-C水平显著降低(P<0.05)。与无MACE组相比,MACE组患者血清中lncRNA PVT1和FOXM1水平显著升高(P<0.05)。MACE组的LGE-MRI阳性数量显著高于无MACE组(P<0.)05。与LGE-MRI、血清lncRNA PVT1和FOXM1单独预测相比,三者联合预测MACE发生的AUC更高(Z=7.221,P<0.001;Z=7.737,P<0.001;Z=7.091,P<0.001)。结论 缺血性心脏病预后发生MACE的患者血清lncRNA PVT1和FOXM1水平呈高表达,二者联合LGE-MRI对MACE的发生有一定的预测价值。

eRNA AP003469.2与肝细胞癌患者预后的相关性分析

目的通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库筛选肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中关键的增强子RNA(enhancer RNA,eRNA),探究其作为HCC预后分子和治疗靶点的潜力。方法从TCGA数据库中检索下载33种癌症类型的基因表达RNA-seq配置文件,应用Kaplan-Meier生存分析和Spearman相关分析筛选与HCC患者生存相关的eRNA和靶基因。评估目的eRNA与临床特征的相关性。进行基因集富集分析以研究目的eRNA潜在的生物学功能。在HCC细胞株Hep 3B中分别构建AP003469.2和靶基因酪氨酸/色氨酸羟化酶激活蛋白ζ(tyrosine and tryptophan hydroxylase activators zeta,YWHAZ)功能缺失细胞模型,定量实时PCR检测AP003469.2敲低后对YWHAZ表达的影响。应用体外增殖实验和transwell实验探究AP003469.2和YWHAZ敲低对细胞增殖和迁移、侵袭能力的影响。在泛癌中验证目的eRNA在其他癌种中的预后潜能。结果在HCC中,AP003469.2和靶基因YWHAZ与患者不良预后相关,且AP003469.2的表达在患者的组织病理学分级、AJCC分期和T分期方面,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。基因和通路富集分析结果显示,AP003469.2与参与中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞活化、细胞外基质降解、细胞骨架蛋白重构、细胞伪足和细胞黏附等生物学行为的分子和调控通路相关;进一步分析发现,AP003469.2可能通过中性粒细胞细胞陷阱和细胞伪足调控HCC的发生和发展。定量实时PCR实验证实AP003469.2对靶基因YWHAZ转录的促进作用(P<0.05)。CCK-8和transwell实验表明,AP003469.2和YWHAZ敲低均可抑制HCC细胞株Hep 3B的增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.01)。结论AP003469.2可能是HCC中的关键eRNA,有潜力成为HCC早期诊断和预后的标志物和治疗靶点。

HS5-1增强子eRNA PEARL对原钙粘蛋白α基因簇的表达调控

远端增强子对关键靶基因的表达调控通常可以决定细胞的命运和功能,激活的增强子可以双向转录产生长非编码(long noncoding)增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)调控靶基因表达,课题组前期研究发现增强子eRNA能够通过形成R环(R-loop)来促进增强子与靶基因的染色质远距离互作,引起局部三维基因组TAD(topologically associated domain)的改变。为了进一步探究eRNA在基因转录过程中的生物学功能,本研究选取原钙粘蛋白(protocadherin,Pcdh)基因簇的增强子eRNA PEARL(Pcdh eRNA associated with R-loop formation)作为研究对象,通过CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)DNA片段编辑技术、逆转录PCR、荧光定量PCR等遗传学和分子生物学实验,揭示了增强子eRNA PEARL对Pcdhα基因簇表达的促进作用。首先,本研究通过分析不同组织中HS5-1增强子eRNA发现其表达具有组织特异性;其次,通过CRISPR诱导HS5-1增强子内CTCF结合位点的反转或缺失会造成增强子eRNA PEARL转录水平降低至2%~10%,同时Pcdhα基因簇的转录水平也会降低至原来的13%~68%;最后,利用CRISPR DNA片段编辑技术删除HS5-1 eRNA双向转录起始位点或反转eRNA PEARL的转录起始位点后,Pcdhα基因簇的转录水平下降了约60%或40%,表明HS5-1增强子eRNA在调控基因表达中发挥重要作用。以上研究结果进一步证实了HS5-1增强子的转录产物可以调控Pcdhα基因簇的表达,为后续研究原钙粘蛋白基因簇在大脑中的表达调控机制提供了新的思路或方向。

LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2对肺间质细胞增殖、迁移及侵袭的作用

目的研究长链非编码RNA FEZ家族锌指1-反义RNA 1(lncRNA FEZF1-AS1)调控zeste同源物增强子2(EZH2)对肺间质细胞增殖、迁移、侵袭能力及上皮细胞-间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法将人肺腺癌细胞系A549分为对照组(control)和模型组[model,用转化生长因子β1(TGF-β1)20 ng/mL作用48 h,诱导成为肺间质细胞]。用Western blot检测细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(vimentin)的蛋白表达。RT-qPCR检测细胞中lncRNA FEZF1-AS1和EZH2基因表达。转染组细胞分为转染si NC组、si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组和si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2组。CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移、Transwell小室法检测细胞侵袭;用Western blot检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin及EZH2的蛋白表达,用RNA免疫沉淀(RIP)测定FEZF1-AS1与EZH2的直接结合作用。结果与对照组比较,模型组E-cadherin的蛋白表达水平减少(P<0.05);N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平升高(P<0.05);与对照组比较,模型组lncRNA FEZF1-AS1与EZH2基因的表达水平明显升高(P<0.05);与si NC组相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、vimentin、EZH2蛋白表达降低(P<0.05);与si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组比较,si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZHZ组细胞增殖、侵袭、迁移能力升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、vimentin、EZH2蛋白表达升高(P<0.05);RIP实验进一步证实了lncRNA FEZF1-AS1与EZH2具有结合作用。结论LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2促进肺间质细胞增殖、侵袭、转移和EMT过程。

幽门螺杆菌诱导增强子RNA调控MYC促进胃癌的作用及机制研究

目的探究幽门螺杆菌(H.pylori)诱导增强子RNA(eRNA)的表达,eRNA对原癌基因MYC的调控作用及eRNA调控MYC的分子机制,探索eRNA在胃癌发生和发展中的作用。方法根据胃上皮细胞GES-1与H.pylori共培养后测得的RNA-seq筛选差异基因MYC,通过ATAC-seq、CUTTag确定MYC的eRNA(eMYC)。采用RT-qPCR检测GES-1感染H.pylori前后eMYC和MYC的表达量。使用Western blot检测蛋白含量变化。敲低eMYC后采用RT-qPCR检测MYC的表达量来检验eMYC对MYC的调控作用。采用CUTRUN探究eMYC调控MYC的机制。在胃癌细胞系MKN1中使用RT-qPCR检测eMYC和MYC在感染H.pylori后表达水平的变化,使用EdU检测细胞增殖能力,使用流式细胞术检测细胞凋亡。结果原癌基因MYC在H.pylori感染后表达增加(FDR<1×10-300),MYC基因上下游1MB以内存在染色质开放区域(FDR<0.05)。CUTTag结果显示,H3K27ac、H3K4me1和RNA聚合酶Ⅱ在这个区域呈现高信号。RT-qPCR结果显示,eMYC和MYC的表达水平在GES-1细胞感染H.pylori后都升高(P<0.001),MYC蛋白含量升高。敲低eMYC后,MYC的表达水平(P<0.001)和蛋白含量降低。CUTRUN实验结果显示,敲低eMYC后,eMYC转录位置基因组区域富集到的H3K27ac和BRD4含量降低(P<0.01)。MKN1感染H.pylori后eMYC和MYC的表达水平升高(P<0.01),敲低eMYC后细胞增殖能力降低(P<0.001),细胞凋亡增加(P<0.05)。结论H.pylori感染诱导eMYC的表达,通过影响H3K27ac修饰以及与BRD4相互作用促进原癌基因MYC的转录,在胃癌的发生中有重要作用。eMYC促进胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡,与胃癌的进展有关。

增强子RNA ENSR00000313345在头颈鳞癌发展中的作用研究

目的:探究增强子RNA(eRNA)ENSR00000313345在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中的作用。方法:通过Spearman相关性分析检测生存相关eRNA ENSR00000313345与其假定靶基因WWC2之间的共表达。通过实时荧光定量PCR检测HNSCC细胞中eRNA ENSR00000313345的表达;在HNSCC细胞中转染小干扰RNA以敲低eRNA ENSR00000313345,采用CCK⁃8、划痕实验、Transwell迁移实验探讨eRNA ENSR00000313345对HNSCC细胞增殖、迁移的影响。在HNSCC细胞中转染小干扰RNA以敲低WWC2,通过CCK⁃8、划痕实验、Transwell迁移实验以检测WWC2对HNSCC细胞增殖、迁移的影响。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测eRNA ENSR00000313345与WWC2的相关性。结果:WWC2的表达量与EN⁃SR00000313345呈正相关。eRNA ENSR00000313345在HNSCC细胞系中的表达量高于口腔黏膜角化上皮细胞系(P<0.05)。敲低eRNA ENSR00000313345可以抑制HNSCC细胞的增殖、迁移(P<0.05)。敲低WWC2能够抑制HNSCC细胞的增殖、迁移(P<0.05)。敲低eRNA ENSR00000313345时,WWC2的表达水平随之下调(P<0.05)。结论:eRNA ENSR00000313345可以通过调控WWC2表达进而促进HNSCC细胞的增殖与迁移。

银胶中三螺旋RNA poly（rU）．poly（rA）．poly（rU）的付立叶表面增强拉曼光谱研究

采用近红外付上叶拉曼光谱研究了三螺旋ＲＮＡ（ｒＵ）．ｐｏｌｙ（ｒＡ）．ｐｏｌｙ（ｒＵ）在溶液中的构象和在银胶中的表面增强拉曼散射行为。结果表明在溶液中，该三螺旋ＲＮＡ分子中以Ｗａｔｓｏｎ—Ｃｒｉｃｋ碱基配对的两条链处于Ａ－构型，而第二条嘧啶链处于Ｃ２＇－ｅｎｄｏ／ａｎｔｉ构象。在银胶中，该三螺旋ＲＮＡ的表面增强拉曼效应明显。与溶液状态下相比，８３５和８１９ｃｍ－１谱带的出现暗示该三螺旋ＲＮＡ吸附到银胶表面后，该三螺旋ＲＮＡ分子的螺旋结构仍得到保留，且其构象与溶液中的相近。同时该三螺旋ＲＮＡ主要是通过核酸骨架上带负电荷的磷酸基团定位于银胶表面而吸附的。

小干扰RNA对人淀粉样前体蛋白基因的沉默作用(英文)

目的观察小干扰RNA(siRNA)对人淀粉样前体蛋白(APP)基因的沉默作用。方法该研究将设计好的一对寡核甘酸在细胞内源性地转录成小发夹RNA(shRNA),同时构建了携带两个APP亚型的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的GFP-APP重组质粒。利用EGFP作为报告基因,在COS-7细胞内通过共转染siRNA表达质粒和GFP-APP的重组质粒来观察沉默效应。结果针对APP的siRNA可有效地下调APP基因。结论针对APP的siRNA将不仅在研究APP基因功能和深入研究阿尔茨海默病(AD)的病理分子机制上,而且在运用siRNA这种新型的反义核酸药物治疗AD方面扮演重要角色。

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的: 构建针对增强型(EGFP)的pSUPERsiRNA(smallinterferencingRNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS 7细胞中观察其干扰效果.方法: 设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BglⅡ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2 EG FP瞬时共转染COS 7细胞, 48h后荧光显微镜下观察干扰效果.结果: 经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段.瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示: 只转染pIRES2 EGFP及共转染pIRES2 EGFP和空载体pSUPER的COS 7细胞中有大量的EGFP表达.而共转染pIRES2 EGFP和pSUPER R237、pSUPER R304、pSUPER R447的COS 7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低.结论: 成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER R237,pSUPER R304和pSUPER R447,并与pIR ESE2 EGFP瞬时共转染COS 7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达.

探讨多聚胞嘧啶结合蛋白E2诱骗RNA对32D-BCR／ABL细胞增殖的影响

目的:在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由慢性期向急性期的过渡阶段伴随有多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的异常表达。本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA(decoy RNA)对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响及其可能的分子机制。方法:用电转染方法将hnRNP E2诱骗RNA野生序列和突变序列的表达载体(pGD和pGM)转入32D-BCR/ABL细胞,用G418筛选出稳定表达诱骗RNA的细胞。锥虫蓝染色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。FCM分析细胞周期,RT-PCR和Western印迹法检测下游CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-bindingproteinα,C/EBPα)和c-Myc的表达。结果:筛选出稳定表达野生型和突变型诱骗RNA的32DP210-pGD细胞和32DP210-pGM细胞。野生型32DP210-pGD细胞与未转染32D-BCR/ABL细胞相比,其细胞增殖抑制率为(69.48±5.21)%,克隆形成能力明显减弱,细胞周期由G0/G1期向S期进展受阻;C/EBPαmRNA水平无改变,但在蛋白水平上42 ku-C/EBPα的表达增加(43.83±4.91)%;c-Myc mRNA水平下降(35.67±6.64)%,蛋白水平降低(30.91±3.84)%。突变型32DP210-pGM细胞与未转染32D-BCR/ABL的细胞相比,其上述各指标无明显差异。结论:hnRNP E2诱骗RNA能够抑制32D-BCR/ABL细胞的增殖,其机制可能是诱骗RNA阻断hnRNP E2和C/EBPαmRNA的结合,引起42 ku-C/EBPα表达增加,进而引起其下游靶基因c-Myc下调。

dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究

目的 观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法 将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞，Western bloting检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达，0．5％锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力。结果 200、300nmol／L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达，而50～200nmol／L浓度的dsRNA有利于干细胞存活。结论 dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时，最大限度地保持细胞活力。

MEF2A RNA干扰对小鼠主动脉内皮细胞MEF2A表达及细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1表达的影响

目的:观察肌细胞增强因子2A(MEF2A)RNA干扰对小鼠主动脉内皮细胞MEF2A及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响。方法:培养小鼠主动脉内皮细胞,构建MEF2A RNA干扰慢病毒或者阴性对照慢病毒(NC)并转染小鼠主动脉内皮细胞。实验设对照组(不加慢病毒)、NC组和MEF2A RNA干扰组3组,应用ELISA和RT-PCR法分别检测MEF2A及ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表达水平。结果:ICAM-1在对照组、NC组和MEF2A RNA干扰组上清液中的表达量分别为(1.133±0.182)、(1.267±0.115)、(2.249±0.185)μg/L;VCAM-1在对照组、NC组和MEF2A RNA干扰组上清液中的表达量分别为(2.382±0.204)、(2.253±0.281)、(5.077±0.198)μg/L。ICAM-1、VCAM-1在上清液中的水平及mRNA表达水平,NC组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);MEF2A RNA干扰组与对照组和NC组相比均升高(P<0.05)。结论:慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF2A活性及mRNA的表达,并可促进血管内ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA的表达。

小干扰RNA表达载体介导的EOLA1基因表达抑制研究

目的 设计和构建EOLA1基因特异性的小干扰RNA质粒 ,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 将靶点特异性的寡核苷酸连接到经ApaⅠ EcoRⅠ酶切线性化的pBS/U6质粒 ,测序验证 ,阳性重组质粒转染ECV3 0 4细胞 ,半定量RT PCR方法检测靶基因的表达 ,阳性重组质粒与pEGFP EOLA1共转染 ,观察外源报告基因绿色荧光蛋白的表达。结果 构建的阳性重组质粒转染能够抑制靶基因EOLA1mRNA的表达 ,并能够显著抑制EOLA1 EGFP融合蛋白的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒 ,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

小分子干扰RNA沉默果蝇zeste基因增强子同源物2对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)对宫颈癌Hela细胞顺铂敏感性的影响。方法培养宫颈癌Hela细胞,收集对数生长期Hela细胞继续培养,待贴壁细胞长满底部面积80%～90%时进行转染。将Hela细胞随机分为空白对照组、control siRNA组和EZH2 siRNA组,空白对照组Hela细胞不作处理,control siRNA组Hela细胞转染control siRNA,EZH2 siRNA组Hela细胞转染EZH2 siRNA。收集3组转染后Hela细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测Hela细胞中EZH2 mRNA表达,Western blot法检测Hela细胞中EZH2蛋白表达,流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期。收集3组转染后Hela细胞,分别加入不同质量浓度(0. 0、12. 5、25. 0、50. 0、100. 0、200. 0 g·L^(-1))的顺铂,48 h后采用四甲基偶氮唑蓝法检测Hela细胞在顺铂作用下的体外存活率。结果 Control siRNA和EZH2 siRNA可高效转染Hela细胞,转染率均达90%以上。空白对照组、control siRNA组和EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2 mRNA相对表达量分别为396. 7±88. 4、389. 2±70. 6和98. 5±20. 3,EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2 mRNA相对表达量显著低于空白对照组和control siRNA组(t=2. 057、2. 015,P <0. 01),空白对照组与control siRNA组Hela细胞中EZH2 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(t=1. 476,P> 0. 05)。空白对照组、control siRNA组和EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2蛋白相对表达量分别为509. 4±110. 7、497. 5±80. 4和120. 4±31. 3,EZH2 siRNA组Hela细胞中EZH2蛋白相对表达量显著低于空白对照组和control siRNA组(t=2. 682、2. 597,P <0. 01),空白对照组与control siRNA组Hela细胞中EZH2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=1. 943,P> 0. 05)。EZH2 siRNA组G_0/G_1期细胞比例显著高于空白对照组和control siRNA组(t=2. 893、3. 087,P <0. 05),EZH2 siRNA组S期、G_2/M期细胞比例显著低于空白对照组和control siRNA组(EZH2 siRNA组与空白对照组比较:t=2. 526、5. 462,P <0. 05; EZH2 siRNA组与control siRNA组比较:t=2. 498、5. 417,P <0. 05),空白对照组与control siRNA组G_0/G_1期、S期及G_2/M期细胞比例比较差异均无统计学意义(t=0. 926、1. 017、0. 947,P> 0. 05)。不同质量浓度顺铂作用48 h后,同一质量浓度下EZH2 siRNA组Hela细胞的存活率明显低于空白对照组及control siRNA组(P <0. 05),且随着顺铂浓度的增加,3组Hela细胞的存活率均呈逐渐下降趋势。结论沉默EZH2表达可提高宫颈癌Hela细胞对顺铂的敏感性,而阻滞细胞周期可能是其主要作用机制之一。

EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

目的采用基因工程技术,构建EZH2 shRNA的真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌A2780细胞系。方法合成特异性干扰EZH2的shRNA片段并定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得表达载体pGPU6/GFP/Neo-shEZH2。脂质体介导重组质粒转染A2780细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,Real time RT-PCR和Western blot检测转染后细胞系EZH2的表达。结果测序结果证实重组载体构建成功,稳定转染shEZH2的A2780细胞EZH2的mRNA和蛋白水平下降(90.20±1.66)%和(73.80±5.49)%,P<0.01,差异有统计学意义。结论成功构建EZH2 shRNA表达载体,获得EZH2基因稳定沉默的A2780细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础。

MEF2A RNA干扰对apoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块及血清Lp-PLA2、MCP-1表达的影响

目的:观察肌细胞增强因子2A(MEF2A)表达下降对载脂蛋白E基因敲除(apoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化(AS)斑块形成及脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法:高脂喂养apoE^(-/-)小鼠以构建AS模型。45只模型小鼠被分为MEF2A RNAi组、阴性对照组(NC组)和对照组,每组15只。MEF2A RNAi组动脉局部斑块滴注慢病毒悬液,NC组动脉局部斑块滴注NC慢病毒悬液,对照组滴加生理盐水,术后继续高脂喂养,5周后进行组织学检查。采用ELISA和real-time PCR法检测血清和斑块局部MEF2A及Lp-PLA2、MCP-1表达的变化。结果:MEF2A RNAi组与对照组、NC组相比,血清MEF2A水平降低,Lp-PLA2、MCP-1水平升高(P<0.05);AS斑块增厚,面积增大,斑块局部MEF2A mRNA表达水平降低,Lp-PLA2、MCP-1 mRNA表达水平增高(P<0.05)。结论:在体内apo E缺失时,抑制MEF2A活性可增强Lp-PLA2、MCP-1表达,促进AS及斑块形成。

RNA干扰技术抑制哺乳动物细胞绿色荧光蛋白表达的研究

目的本研究旨在探讨阳离子脂质体的体外转染效率、化学合成双链RNA(dsRNA)诱导RNA干扰(RNAi)的效应强度及其作用特点,为采用RNAi技术开展基因治疗提供实验依据。方法①采用磷酸钙沉淀法构建293T/GFP细胞株。②体外化学合成dsRNA,经由三种不同的阳离子脂质体TransIT-TKO,Oligofectamine reagent,Lipofectamine2000导入293T/GFP细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪测定荧光强度的变化,观察不同阳离子脂质体的体外转染效率。③采用dsRNA-Lipofectamine2000复合物转染293T/GFP细胞。dsRNA分设5个不同的浓度(0.01,0.02,0.04,0.08,0.16μmol/L)转染细胞48h以观察剂量效应关系。dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl转染细胞,于4个不同的时间点(12h,24h,48h,72h)观察时间效应关系。结果绿色荧光蛋白序列特异性dsRNA(dsRNA-eGFP)经由三种不同的阳离子脂质体导入细胞均可产生RNAi效应,序列非特异性dsRNA(dsRNA-unrelated)无抑制效应。在三种不同的阳离子脂质体中,Lipofectamine2000的转染效率最强,转染48h可将293T/GFP细胞荧光强度降低约80%,与空白载体组比较差异显著,TransIT-TKO组,Oligofectamine reagent组分别降低41.02%、37.45%,与空白载体组比较无显著性差异,而且TransIT-TKO、Oligofectamine的细胞毒性较强。结果还表明dsRNA/Lipo-fectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性,dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl/6孔培养板转染细胞48h的抑制效应最强。结论①体外化学合成的dsRNA可有效诱导哺乳动物细胞出现序列特异性基因沉默效应。②三种不同的阳离子脂质体中Lipofectamine2000的转染效率最强,且细胞毒性轻微。③dsRNA/Lipofectamine2000诱导的RNAi效应具有剂量及时间双重依赖性。

PSMA增强子/启动子特异性驱动shRNA靶向干扰EGFP的研究

目的:探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA转录效果,比较何种终止序列最有效。方法:分别以poly(A),minipoly(A),poly(U)为终止序列设计针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的干扰序列,克隆入经SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pPSMAe/p载体上。然后通过脂质体介导,将各重组干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染PC-3和LNCaP细胞,采用荧光显微镜,流式细胞仪,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测EGFP在各组细胞中的干扰效果。结果:重组质粒中成功插入了目的基因片段;荧光显微镜和流式测定结果显示各干扰质粒与pEGFP-C1质粒共转染LNCaP后,各干扰组荧光表达均有不同程度减少,与空载体组相比均有统计学差异(P<0.01),pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)组减少与pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)组相比有统计学差异(P<0.05),与pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)组相比有显著统计学差异(P<0.01)。各干扰载体与pEGFP-C1质粒共转染PC-3后各组荧光表达无统计学差异(P>0.05),EGFP mRNA和蛋白表达水平无明显差异;LNCaP细胞各干扰组中EGFP mRNA和蛋白表达与空载体对照组相比均有不同程度下降,以pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)组最为明显。结论:成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)、pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)和pPSMAe/p-shEGFP-poly(U);PSMAe/p可特异性驱动shRNA转录;poly(A)终止信号终止转录最有效。