氯虫苯甲酰胺及其代谢物IN-EQW78对蚯蚓氧化应激及繁殖能力的影响

为明确氯虫苯甲酰胺(CAP)及其代谢物氯虫苯甲酰胺脱水环化物(IN-EQW78)对蚯蚓毒性效应的差异,开展了CAP和代谢物IN-EQW78对蚯蚓的56 d单一暴露实验,探讨2种化合物分别对蚯蚓氧化应激及繁殖能力的影响。结果表明,5 mg·kg^(-1)的CAP暴露14 d后,过氧化氢酶(CAT)活性显著上升,超氧化物歧化酶(SOD)活性在28 d时明显增强;IN-EQW78暴露7 d后,SOD和谷胱甘肽转移酶(GSH-ST)活性增强,而CAT活性降低。IN-EQW78比CAP会更早地引起蚯蚓氧化应激效应,并引发更大的氧化损伤。5 mg·kg^(-1)的CAP处理减少了蚯蚓精子数量,破坏卵巢结构,对生殖系统造成损伤,并进一步抑制蚯蚓繁殖,导致56 d时幼蚓数量显著下降;而IN-EQW78(≥0.04 mg·kg^(-1))处理对卵巢无损伤,反而引起蚯蚓精子数量增加,从而促进蚯蚓繁殖,显著提高了56 d时幼蚓及蚓茧数量。本研究揭示了CAP及其代谢物对蚯蚓的潜在影响,为农业生产中CAP的风险评估提供了科学依据。

菲和芘对蚯蚓(Eisenia fetida)细胞色素P450和抗氧化酶系的影响

研究了菲和芘在单一低剂量污染胁迫下对蚯蚓(Eisenia fetida)体内细胞色素P450酶系和抗氧化酶系的影响.通过滤纸接触染毒法,检测蚯蚓细胞色素P450含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性.结果表明,在供试浓度范围内,蚯蚓体内细胞色素P450含量和三种抗氧化酶活性均对毒物产生了不同程度的响应.菲和芘在蚯蚓体内的代谢诱发了细胞色素P450总含量的增加,且在此过程中有活性氧自由基产生.不同酶对毒性效应响应的域值不同,其敏感性大小为:P450>SOD(POD)>CAT.根据四个指标对污染物浓度响应的域值不同,可将四者联合应用互为补充作为一套生物标记物体系,以满足污染物不同暴露浓度下土壤的毒理诊断,增强指示的敏感性和有效性.

铜暴露对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)抗氧化酶活力的影响

通过溶液接触法和人工土壤法,研究了不同暴露环境中Cu对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)SOD酶、CAT酶和GST酶活力的影响.结果显示:溶液接触试验中,Cu显著抑制蚯蚓SOD酶活力(P<0.05),人工土壤试验中Cu则诱导SOD酶活力增加,预示暴露条件影响蚯蚓SOD酶对Cu的生物响应.人工土壤试验中,Cu暴露浓度与蚯蚓CAT酶和GST酶活力的相关系数分别为0.814和0.933,均存在极显著的剂量效应关系(P<0.001).在这两种暴露环境下,赤子爱胜蚓的CAT酶和GST酶活力对Cu浓度响应敏感.

Eisenia fetida中蚯蚓纤溶酶P-Ⅲ组分序列多态性

为了探讨蚯蚓纤溶酶P-Ⅲ组分序列多态性及其与蚓种关系。从Eiseniafetida中提取总RNA,利用P-Ⅲ组分序列两端的保守性设计引物,通过RT-PCR获得P-Ⅲ组分基因,并构建该组分质粒(pUC18)文库,经PCR筛选后进行序列测定及分析。在原已获得的Efp-Ⅲ-1和Efp-Ⅲ-3的基础上,利用中间引物从文库中筛选到Efp-Ⅲ-2基因。序列分析表明,该基因编码序列为720bp,编码239个氨基酸,与GenBank报道的Efp-Ⅲ-2五条序列整体相似性高达99.02%。通过序列比对,发现Efp-Ⅲ-1、2和3具有完全相同的结构域,差异位点零星分布在序列中间;Lumbricus rubellus的六条序列同样具有Eisenia fetida这个特点,并无明显差异。序列比对证明它们是蚯蚓体内P-Ⅲ组分基因多态性的表现,而且在Lumbricidae科中与蚓种无关。

两种生态类型蚯蚓几种消化酶活性比较研究

蚯蚓在有机残体转化和土壤养分循环中起着重要的作用 ,为明确不同生态类型蚯蚓的食性及其消化有机物质的能力 ,测定了表居型蚯蚓赤爱胜蚓 ( Eisenia fetida)和上食下居型蚯蚓威廉环毛蚓 ( Pheretima guillemi)肠道内纤维素酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性 ;同时还对威廉环毛蚓排泄物中蛋白酶、磷酸酶以及 CO2 呼吸强度与原土进行了比较。结果表明 ,赤爱胜蚓肠道内纤维素酶活性远远高于威廉环毛蚓 ,而蛋白酶和酸性及碱性磷酸酶活性显著低于威廉环毛蚓 ;两种蚯蚓肠道消化酶活化的差异与赤爱胜蚓直接以植物残体为食 ,而威廉环毛蚓以半分解的有机残体上的微生物为食有关。根据研究结果 ,提出了饲养环毛蚓时要注意增加饵料中微生物量的观点。

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)的分离纯化

为获得一种高效，低廉的溶栓药物，从赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆａｅｔｉｄａ）体内分离纯化出一种可体外激活纤溶酶原从而间接降解纤维蛋白的酶（ｅ－ＰＡ）．纯化过程包括：粗品的盐析，离子交换层析，凝胶过滤层析及疏水相互作用层析．该组份是由二个亚基通过疏水相互作用维系在一起的．通过凝胶过滤层析，可测得全酶的分子量为４５０００；ＳＤＳ电泳显示大、小亚基的分子量分别是２６０００与１８０００；而质谱法测得的大、小亚基的分子量分别为２４５５６．７与１５５４６．６．对大小亚基进行了氨基酸组成分析，结果显示大亚基不含Ｌｙｓ而小亚基不含Ｃｙｓ．测定了大亚基Ｎ端２５个氨基酸序列：ＶＩＧＧＴＮＡＳＰＧＥＩＰＷＱＬＳＱＱＲＱＳＧＳＷ．并与部分已知蛋白质序列进行了比较．

一种体内溶栓活性优于总蚯蚓纤溶酶的组分

目的筛选高效低毒的蚯蚓纤溶酶单一组分。方法通过亲和色谱从赤子爱胜蚓获得含多组分的总蚯蚓纤溶酶(EFE),经离子交换分离得到3个主要溶栓组分EfP-0-2,EfP-I-1和EfP-I-2,与EFE比较体内外溶栓效果和毒副作用。结果与其他组分比较,EfP-I-1的体外溶栓作用较强;当静脉注射4.5 mg.kg-1时,各组分对纤维蛋白原的影响均不明显,只有EfP-I-1能显著溶解动静脉旁路血栓;当静脉注射达6 mg.kg-1时,只有该组分对延长出血时间的影响不明显;急性毒性实验表明,该组分的LD50是EFE的2.17倍。结论EfP-I-1有较高的体内外溶栓活性和较低的毒副作用。由于该组分在总EFE中所占比例较高,并易于分离纯化,故适于作为单一组分的溶栓药物进行开发。

蚯蚓细胞色素P450生物标记物方法研究

以蚯蚓（Eisenia fetida）为试验动物，通过强化预处理（盐水洗脱）、改变离心力和溶解微粒体膜等实验，建立了蚯蚓细胞色素P450含量的定性、定量测定方法．在此基础上，以多环芳烃（菲）为供试外源污染物，分别以滤纸接触法和土壤投加法，进行了蚯蚓细胞色素P450含量与菲污染诱导的量-效关系试验．结果表明，增加和调整离心力，加入增溶剂等方法，可有效去除干扰，使蚯蚓微粒体样品的450峰值由完全被干扰掩盖（在455～457nm处滞后出现），转变为在450nm±1nm达到最大值，滤纸接触试验（10^-6，10^-5，10^-4，10^-3和10^-2mg·mL^-1）和土壤染毒试验（1，2，4，8mg·kg^-1）均表明，蚯蚓体内P450含量与菲浓度存在量-效关系,对土壤染毒不同诱导时间（1，3，7，14，28d）的测定结果表明，不同浓度的菲对蚯蚓毒性为诱导刺激（7d）效应和诱导抑制（14d和28d）效应，导致蚯蚓体内P450总量分别为对照组的0．99～1．41倍及0．77～0．88倍（P〈0．05）．蚯蚓细胞色素P450含量测定方法具有简单、快速、低耗、敏感的优点，是适合于土壤低剂量污染暴露毒性诊断的生物标记物指标。

三种兽药在不同暴露系统对蚯蚓的急性毒性

采用人工土壤法和滤纸法对不同浓度的阿维菌素、安普霉素、磺胺二甲基嘧啶3种常用兽药对蚯蚓的急性毒性进行了研究。结果表明,用土壤法和滤纸法测定的阿维菌素对蚯蚓的半数致死浓度(LC50)分别为17.06mg·kg-1和4.63×10-3mg·cm-2,阿维菌素对蚯蚓具有一定的毒性作用,其皮肤接触毒性比土壤食入毒性更大。用滤纸法测定的安普霉素、磺胺二甲基嘧啶对蚯蚓的半数致死浓度(LC50)分别大于10mg·cm-2和15mg·cm-2;用土壤法测定安普霉素、磺胺二甲基嘧啶对蚯蚓的半数致死浓度(LC50)均大于5000mg·kg-1,表明安普霉素、磺胺二甲基嘧啶对蚯蚓的毒性较低。

土壤甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓及小麦的毒性效应

以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)和小麦(Triticum aestivum L.)为受试生物,研究了土壤中甲苯、乙苯和二甲苯等苯系物(TEX)的毒性效应.结果表明,3种污染物对赤子爱胜蚓和小麦毒性影响呈明显的剂量-效应关系,甲苯、乙苯和二甲苯对蚯蚓的24hLC50分别为583.6,346.8,192.4mg/kg;48h LC50分别为454.3,167.1,127.2mg/kg.甲苯、乙苯和二甲苯对小麦芽伸长的10%抑制率(IC10)分别为342.2,195.4,45.9mg/kg;对小麦根伸长的10%抑制率(IC10)分别为206.7,134.5,26.3mg/kg.小麦芽长、根长均可用于指示土壤被甲苯、乙苯及二甲苯污染的程度,但小麦种子根长对3种污染物胁迫的响应较芽长更为敏感,根长抑制率与芽长抑制率之间呈明显的相关关系.

蚯蚓纤溶酶的纯化及pH值、温度和胰蛋白酶对其纤溶活性的影响

目的纯化并鉴定蚯蚓纤溶酶 ,研究pH、温度和胰蛋白酶对其纤溶活性的影响。方法以赤子爱胜蚓为材料 ,采用硫酸铵盐析、DEAESepharoseCL 6B离子交换色谱、SephadexG 75凝胶过滤和制备电泳等分离技术纯化蚯蚓纤溶酶 ;利用纤维平板和聚丙烯酰胺凝胶电泳研究pH、温度和胰蛋白酶对蚯蚓纤溶酶纤溶活性的影响。结果分离得到纤溶酶 4种单一组分 :EFE 1、EFE 2、EFE 3、EFE 4 ;分子量分别为 2 70 0 0、2 80 0 0、2 30 0 0、330 0 0 ;4种组分对温度的适应范围较广 ;pH值对其纤溶活性的影响不尽相同 ,但都在pH低于 1.5时纤溶活性完全丧失 ;胰蛋白酶对纤溶酶 4种组分均无降解作用 ,对其纤溶活性无影响。

赤子爱胜蚓五种纤溶酶组分的分离纯化及对纤维蛋白原酶解的初步研究

经硫酸铵盐析沉淀和ＰＡＧＥ制备电泳，从赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆｏｅｌｉｄｅ）粗品中分离纯化出五种纤溶酶组份（Ⅰ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ），在ＰＡＧＥ中均呈现单一带。组份Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ能将纤维蛋白原中α、β、γ链依次降解，对α链亲和力最大。组份Ｘ不能降解４３．５ＫＤ、４０ＫＤ、２４．５ＫＤ片段。组份Ⅰ对α链有较高亲和力而对γ链无降解作用。

富硒蚯蚓的培养及其硒富集作用研究

以赤子爱胜蚓为生物载体,在蚯蚓饲料中添加亚硒酸钠进行富硒蚯蚓培养试验,利用蚯蚓的生物富集作用将无机硒转化为有机硒。以存活率、硒含量为优化指标,研究5种硒浓度(20、40、60、80、100 mg·kg-1)和4种培养时间(第15、30、45、60 d)对蚯蚓生长和硒含量的影响规律,筛选存活率高、硒含量高、培养时间短的富硒蚯蚓培养方法。试验结果表明:蚯蚓饲料中亚硒酸钠含量越高、培养时间越长,蚯蚓的存活率越低,硒含量越高,且当硒添加量为80 mg·kg-1,培养时间为45 d时,培养条件最优,此时蚯蚓体内硒含量可达33.25 mg·kg-1。

超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的操作条件优化研究

目的：重点在于摸索超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的最佳操作条件。方法：以新鲜红地龙的匀浆液为分离对象。以10万膜分离过程为目标过程，以膜通量为指标，来优化压力、温度、表面转速、料液浓度等操作条件。结果：（1）最佳操作条件为：0．25MPa，30℃，200r／min，pH=6．7，地龙浓度为33．3％（W：W），氯化钠的加入量为0。（2）红地龙匀浆液中蛋白物质分子量主要分布在5万-10万。结论：所得实验结果为中试或工业生产提供理论基础和数据支持。

高活力蚯蚓纤溶酶的纯化及性质研究

由电泳得知赤子爱胜蚓ＥｉｓｅｎｉａＦｏｅｌｉｄｅ有６种纤溶酶同工酶。经纯化从中得到一种具强纤溶活性的单组分酶。收率为粗酶粉总活力的１９．１％。该酶分子量为３００００Ｄ，比活为６６６７Ｕ／ｍｇ，在ｐＨ４～１１及２５℃～５５℃温度范围内稳定。

铜、镉单一及复合污染对蚯蚓的急性毒性效应

以赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)为对象,采用滤纸急性毒性试验法研究了铜、镉单一及复合污染对蚯蚓的急性毒性效应。单一试验结果表明,铜和镉对蚯蚓作用24 h的LC50分别为147.3,244.3 mg.L-1,作用48h的LC50分别为72.1,192.1 mg.L-1。复合试验结果表明,铜、镉复合污染24 h对蚯蚓的急性毒性具有明显的协同作用,复合污染48 h时,低浓度的Cu与Cd具有协同作用,高浓度的Cu与Cd具有拮抗作用。

转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓生长、生殖及SOD活性的影响

转基因抗虫棉给人类带来经济效益的同时,也存在生物安全性问题。蚯蚓通过影响土壤的物理和生物性质使土壤肥力发生变化。目前国内外针对转基因抗虫棉对蚯蚓的影响研究十分有限,本研究通过室内喂养试验研究了转基因抗虫棉对赤子爱胜蚓生长、生殖及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。试验设置5个处理:100 g牛粪+500 g土壤(CK)、50 g转基因抗虫棉叶+550 g土壤(50T)、100 g转基因抗虫棉叶+500 g土壤(100T)、50 g非转基因抗虫棉叶+550 g土壤(50NT)、100 g非转基因抗虫棉叶+500 g土壤(100NT)。结果表明,喂养同等剂量转基因抗虫棉叶与非转基因抗虫棉叶的蚯蚓体重变化趋势基本一致,总体来说喂养100 g棉叶(100T和100NT处理)的蚯蚓体重高于喂养50 g棉叶(50T和50NT处理)和喂养牛粪(CK)的蚯蚓。在培养试验结束时,喂养100 g转基因抗虫棉叶(100T处理)蚯蚓体重下降为前一次测定时的23.8%。喂养同等剂量的转基因抗虫棉叶和非转基因抗虫棉叶的蚯蚓茧数和新产生的小蚓数无显著差异(在0 27和0 57之间变化),但喂养100 g转基因抗虫棉叶(100T处理)的小蚓数低于其他处理。在大多数培养时间内,同等剂量转基因抗虫棉叶处理对蚯蚓体内SOD活性的影响与非转基因抗虫棉叶处理差异不显著,但是在试验结束时(201 d),喂养50 g棉叶(50T和50NT处理)的蚯蚓体内SOD活性显著高于喂养100 g棉叶(100T和100NT处理)的蚯蚓。

类二噁多氯联苯对赤子爱胜蚓生理活性的影响

通过人工土壤法,研究0.1,1,10,100,1000μg/kg类二噁多氯联苯暴露浓度对赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)抗氧化酶(SOD酶、CAT酶和GST酶)、抗氧化分子(GSH)、氧化损伤物(MDA)等生理活性指标在第2,7,14,28d时的影响.结果显示,类二噁多氯联苯刺激赤子爱胜蚓生理活性显著增加(P<0.05),可诱导蚯蚓抗氧化系统应答启动;不同暴露时间下,受试物浓度与蚯蚓生理活性的相关性分析显示,蚯蚓不同生理活性指标对受试物的最佳响应时间不同,Cu-ZnSOD响应最早(7d),SOD,CAT,GSH,MDA次之(14d),GST响应最迟(28d);在最佳响应时间下,受试物暴露浓度对数与生理活性值对数均存在显著的剂量-效应关系(P<0.001)

呋喃丹对赤子爱胜蚓体内蛋白含量、SOD和TChE活性的影响

选用杀虫剂呋喃丹对赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)进行染毒试验,研究农药污染对赤子爱胜蚓的致死率和体内蛋白含量、SOD和TChE活力的影响。结果表明:当蚯蚓受到低浓度呋喃丹胁迫时,其体内蛋白含量和TChE的活性均表现为升高趋势,SOD活性表现为降低;当受到高浓度呋喃丹胁迫时,其体内蛋白含量和TChE活性表现为不同程度的降低,SOD却表现为升高;其剂量-效应关系曲线均为抛物线型。可利用蛋白含量、SOD和TChE活性的变化来指示呋喃丹对赤子爱胜蚓的毒性作用。

蚯蚓抗菌肽40 kD Fetidin基因的原核表达与复性

40 kD的fetidin是存在于蚯蚓体腔液中的一种具有较好抗菌活性的蛋白.为了获得大量fe-tidin,从蚯蚓(Eisenia fetida)中调取fetidin的基因,分别克隆到pKW32和pMXB10中,构建了融合和非融合表达载体,并转化大肠杆菌进行诱导表达.结果无论是融合还是非融合表达,产物均以包含体形式存在.融合表达产物通过亲和层析获得复性,复性产物对粘质沙雷氏菌具有抗菌活性.