汗腺样结构钙通道的初步研究

目的:探讨钙离子激动剂和阻滞剂对体外重建的汗腺样结构钙通道的影响作用。方法:酶消化法培养人汗腺上皮细胞,Matrigel中三维重建汗腺样结构,钙荧光探针Fluo-3对汗腺样结构染色,分别在汗腺样结构中适时加入钙离子激动剂和阻滞剂,激光共聚焦显微镜观察其细胞内游离钙离子浓度变化情况。结果:细胞外液钙浓度高时,加入氯化乙酰胆碱后,钙通道开放,细胞外钙内流,细胞内钙浓度明显增加;细胞外液钙浓度高时,先加入阿托品,5min后加入氯化乙酰胆碱,细胞内钙浓度无明显变化。结论:钙离子激动剂能促使汗腺样结构的钙通道开放,钙离子阻滞剂抑制汗腺样结构的钙通道开放。

三维培养汗腺腺上皮细胞形成汗腺样结构的初步研究

目的探索体外构建人外泌汗腺样结构的方法。方法取自愿捐献的正常腋部全层皮肤,分离培养汗腺腺上皮细胞,倒置相差显微镜下观察。将汗腺腺上皮细胞以2×105个/cm2密度接种至Matrigel凝胶下(A组)、凝胶上(B组)、凝胶中(C组),进行三维立体培养,激光扫描共聚焦显微镜、HE染色及免疫组织化学染色观察有无汗腺样结构形成。结果原代汗腺分泌部上皮细胞接种后24 h可见细胞贴壁,贴壁细胞呈梭形,2～3 d后细胞呈多克隆麦粒样生长,14 d后细胞融合呈铺路石样生长,融合后的汗腺腺上皮细胞呈扁平多角形,中间有较大圆形核;第1代细胞形态与原代极为相似;第2代细胞形态不规则,多数伸出长伪足;第3代细胞多呈星形状,细胞体积大,与邻近细胞相互融合。A组汗腺腺上皮细胞三维立体培养11 d形成管腔结构;B组汗腺腺上皮细胞立体培养8 h,细胞胞浆伸长呈丝状,与邻近细胞相连呈管腔或半管腔形,但细胞增殖不明显;C组汗腺腺上皮细胞三维立体培养2～3 d,细胞分裂增生,增生细胞彼此紧密排列成管腔结构,中间可见明显腔隙,随新生细胞增多,管腔结构逐渐演变为不规则球形结构。激光扫描共聚焦显微镜观察示C组形成球形结构,细胞团中央有管腔结构;球形结构HE染色示为管腔结构,免疫组织化学染色示角蛋白18、癌胚抗原表达阳性,与汗腺分泌部管状结构极为相似。结论汗腺腺上皮细胞在Matrigel凝胶中三维立体培养可形成汗腺样结构。

人体外泌汗腺细胞的三维培养及形态学观察

目的探讨人体外泌汗腺组织体外三维培养方法，并对构建的三维组织进行形态学分析。方法取整形手术患者自愿捐赠的正常腹部全层皮肤，经II型胶原酶消化分离人体外泌汗腺组织，以含5ng／mL重组人EGF、25mg／mL牛垂体提取物、100U／mL青霉素和100μg／mL链霉素的无血清角质细胞培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待原代细胞达80％融合后，调整细胞浓度至l×10^5个／mL；取0-3mL细胞悬液与0．3mLMatrigel基底膜基质混匀培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。培养14d后，取标本行冰冻切片，HE染色观察细胞形态结构，免疫组织化学染色检测细胞角蛋白7（cytokeratin7，CK7）和CKl9抗原表达。结果倒置相差显微镜观察示，经II型胶原酶消化后大量汗腺组织游离；贴壁后3～5d长出汗腺细胞，细胞持续分裂达2～3周，形成围绕汗腺组织块的环状单层；3～4周后细胞衰老。汗腺细胞接种于Matrigel基底膜基质中2～3d，细胞开始分裂，随后形成小细胞团、管状结构以及类球状结构；约2周时混合培养物开始液化，培养终止。HE染色示部分细胞形成中空管状结构，管壁由1～2层细胞构成，类似于在体汗腺的分泌部和导管部；免疫组织化学染色见培养的汗腺细胞CK7和CKl9表达均呈阳性。结论人汗腺细胞接种于Matrigel基底膜基质三维培养，形成的组织结构模拟了在体汗腺的组织形态结构。