基于转录组测序的花斑裸鲤SSR、SNP和InDel位点特征分析

为利用分子标记规模化开发与辅助花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)良种选育,以花斑裸鲤(2+龄)的鳃、肾脏和肝脏组织为材料,经总RNA提取和cDNA文库构建后采用Illumina Novaseq 2000平台进行转录组测序,并采用MISA和GATK3软件分析转录组的SSR、SNP和插入缺失标记(InDel)位点特征。结果表明:在486221条Unigenes序列中共发现了128727个SSR,出现频率为26.47%,平均每3.76 kb出现1个SSR;花斑裸鲤SSR包括6个重复类型,以单碱基和二碱基重复基元类型为主,分别占总SSR位点数的46.53%和42.45%,重复基元类型共77种,其中,A/T和AC/GT两种基元的出现频率最高,是花斑裸鲤SSR的优势重复基元;所有重复次数中出现次数最多的为5~15次,占所有SSR位点的87.52%;通过GATK3软件搜索得到399080个SNP位点,转换类型多于颠换类型,分别占总SNP的56.29%和43.71%,转换类型中A/G发生频率略高于C/T,而颠换类型中A/T发生频率最高,C/G发生频率最低;InDel分析显示,从花斑裸鲤转录组Unigenes中共筛选出254065个InDel位点,平均每1903 bp出现1个InDel位点,且SNP位点和InDel位点均以含1个位点的Unigenes数最多。研究表明,花斑裸鲤转录组中SSR、SNP和InDel位点非常丰富,这些位点对花斑裸鲤种质资源鉴定、种群遗传学研究及保护管理具有重要价值。

花斑裸鲤SIRT基因家族分析及低温适应性表达

花斑裸鲤是裂腹鱼亚科的代表物种之一,能够很好地适应青藏高原寒冷的环境。为探究sirtuins(SIRT)基因家族在花斑裸鲤低温适应中的作用,笔者对SIRT基因家族的7个基因进行了生物信息学分析和基因表达研究。结果显示,花斑裸鲤SIRT基因家族的长度差异较大,序列最长的是SIRT1基因(22885 bp),最短的是SIRT4基因(3660 bp),包含蛋白质编码区,编码304至691个氨基酸不等。通过保守结构域和基序分析发现,花斑裸鲤SIRT基因均具有Sir2保守结构域和基序,包括GAGxSx、xxPxxR、PxxxH和QNxDxLx。氨基酸理化性质预测结果表明,花斑裸鲤SIRT蛋白均为亲水性蛋白,除SIRT4之外,均是不稳定蛋白。亚细胞定位预测结果显示,SIRT蛋白主要分布于细胞质和细胞核中。通过预测蛋白质相互作用发现,SIRTs与SOD2、CAT、PPARGC1α、p53、FOXO1a和FOXO1b具有相互作用。进一步对SIRT基因在低温适应的花斑裸鲤的肝脏、脑和肌肉组织中表达进行分析,结果显示,低温下,SIRT2、SIRT4和SIRT7基因在肝脏和脑中表达显著上调,SIRT2~4、SIRT6和SIRT7基因在肌肉中表达显著上调,推测SIRT基因家族尤其是SIRT2、SIRT4和SIRT7基因在花斑裸鲤低温适应中可能具有重要作用。本试验分析了花斑裸鲤SIRT基因家族的特征,其结果可为后续SIRT基因在花斑裸鲤低温适应中功能研究提供基础。

花斑裸鲤红细胞发育相关基因KLF17启动子区域互作蛋白筛选

为了进一步解析鱼类在高原低氧环境下的适应性进化机制,确定相关基因KLF17是否在红细胞发育过程中发挥功能。将高原裂腹鱼亚科鱼类的代表物种——花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)作为实验对象,以实验室前期花斑裸鲤全基因组测序数据为基础,鉴定出红细胞发育相关基因KLF17启动子序列,以其启动子DNA为诱饵,对花斑裸鲤肾脏组织蛋白进行筛选,采用LC-MS/MS技术对候选结合蛋白进行鉴定分析,并进行生物信息学分析。结果表明,在花斑裸鲤肾脏组织中共筛选到576个与KLF17启动子区域特异性结合的蛋白,去除未能鉴定到的蛋白,共有306个候选结合蛋白,其中包括真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、红细胞膜蛋白带4.1蛋白等与红细胞或造血相关的蛋白。GO功能富集分析表明,这些候选结合蛋白涉及多种生物学功能,包括参与细胞生长、细胞周期、免疫反应、信号传导、核酸与转录因子结合等过程。KEGG通路分析表明,以上蛋白参与多条信号通路,包括氨基酸代谢通路、细胞凋亡信号通路、PPAR信号通路、Hippo信号通路、细胞色素P450代谢信号通路、HIF-1信号通路及神经营养因子信号通路等。研究筛选出的KLF17启动子候选结合蛋白主要有参与红细胞发育相关的真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白等,经过功能分析发现它们参与HIF-1信号通路,通过调控血红素、珠蛋白基因表达、铁代谢、血管生成、糖酵解等途径激发红细胞的生成与发育,提示KLF17在转录水平上参与调控红细胞中血红素、铁和珠蛋白间的相互作用,为红细胞分化机制研究提供重要信息。同时,转铁蛋白作为参与铁和氧调节的交叉调控因子,它能够促进血液中铁的运输和增强血氧的结合能力,使得机体在低氧环境中长期生存,这也揭示了花斑裸鲤的低氧适应机制与HIF-1下游的转铁蛋白有关。研究可对下一步验证该蛋白与KLF17的互作机制提供研究基础,为解析高原土著鱼类造血系统发育和低氧环境适应性进化的分子机制提供科学数据。

花斑裸鲤MSTN-1基因克隆及表达特性分析

花斑裸鲤是黄河上游重要的冷水性土著鱼类,其生长、发育缓慢,性成熟又较晚,故多年来其种群一直呈下降趋势。MSTN(肌肉生长抑制素)是一种对肌肉生长具有负调控作用的因子,通过克隆花斑裸鲤MSTN-1基因并检测其表达特性,为花斑裸鲤生长缓慢的分子调控机理提供基础资料。采用PCR、5′-RACE和3′-RACE法获得花斑裸鲤MSTN-1基因全长cDNA序列,采用qPCR检测MSTN-1基因在花斑裸鲤不同组织的表达特征和在不同鲤科鱼类肌肉组织中的差异性表达。花斑裸鲤MSTN-1基因的cDNA序列全长为2190 bp,其中ORF长1128 bp,5′UTR长96 bp,3′UTR长966 bp,共编码375个氨基酸。该蛋白是带有一个信号肽、无跨膜结构的不稳定亲水性分泌蛋白,主要分布在细胞核、线粒体和细胞质中。MSTN-1蛋白质二级结构以无规卷曲为主,存在2个TGF-β结构域:即TGF-β前肽区域(37—268 aa)和TGF-β功能区域(281—375 aa),有1个蛋白酶水解位点RIRR和9个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,花斑裸鲤MSTN-1氨基酸序列与其他鲤科鱼类MSTN-1具有较高的相似性,而与禽类和哺乳动物的相似性较低。系统发育分析显示,花斑裸鲤MSTN-1与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。qPCR检测结果表明,MSTN-1在花斑裸鲤的脑、肌肉、鳃、心、肝脏和肾脏组织中均有表达,但在脑和肌肉组织中表达量较高。该基因在不同鲤科鱼类肌肉组织中均有表达,在青海湖裸鲤肌肉组织中的表达量最高,其次在花斑裸鲤和黄河鲤鱼肌肉组织中。通过克隆获得花斑裸鲤MSTN-1基因cDNA序列,进行生物信息学分析和qPCR检测,MSTN-1在这几种土著鱼类肌肉组织中的特征性表达差异有助于进一步了解高原鱼类生长缓慢的分子机理。

青海湖裸鲤与花斑裸鲤MHCⅡ基因克隆、组织表达及多态性

为探究青海湖裸鲤中主要组织相容性复合体(MHC)基因在免疫功能调节过程中可能发挥的作用,实验利用cDNA末端快速扩增技术(RACE技术)克隆获得了青海湖裸鲤MHCⅡα/β基因和伴侣基因Ii全长cDNA序列以及花斑裸鲤MHCⅡα/β和Ii基因的编码区序列。将获得的基因序列进行对比分析,结果显示,两种鱼中该基因的序列特性基本一致。系统发生树结果显示,两种鱼的MHCⅡ与鲤科鱼类在进化地位上更接近,聚为一支。两种鱼中MHCⅡα/β氨基酸序列均包括信号肽、两个功能区、跨膜区和胞质区,且均在跨膜区发现1个在不同物种中的保守结构。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,青海湖裸鲤MHCⅡ主要在肾脏、脑、鳃、肝脏、臀皮中表达较高,而花斑裸鲤主要在脑、肌肉、眼、鳃中高表达。对比正常状态和感染水霉后青海湖裸鲤鳃、肾脏、肝脏、肠组织中MHCⅡ基因的表达变化,发现MHCⅡ3个基因在肾脏组织中的表达水平显著下调,而MHCⅡα/β基因在鳃、肝脏、肠组织中均显著上调。对青海湖裸鲤进行不同盐碱胁迫处理后,检测到鳃、肾脏组织中MHCⅡ基因的mRNA水平均显著降低。对两种鱼中MHCⅡα/β基因的多态性进行分析,分别获得青海湖裸鲤和花斑裸鲤MHCⅡα 8种、12种等位基因型,分别编码23和24种氨基酸序列,且这种序列多态性主要集中在α1功能区;MHCⅡβ分别获得12、 14种等位基因型,编码22、 23种氨基酸序列。青海湖裸鲤MHCⅡα/β的多态性均低于花斑裸鲤,暗示其与青海湖裸鲤的盐碱耐受过程联系不紧密。遗传多样性分析结果表明群体多样性在两个物种中均较高,其单倍型多样性接近1,且核苷酸多样性之间的差异较小。花斑裸鲤MHCⅡ基因的单倍型多样性和核苷酸多样性均略高于青海湖裸鲤,反映了青海湖裸鲤种群稳定性略低于花斑裸鲤。研究表明,MHCⅡ分子不仅在青海湖裸鲤和花斑裸鲤的免疫防御应答中发挥着重要作用,还可能参与了青海湖裸鲤的盐碱耐受过程,而基因多态性与盐碱耐受的关联度不高。

青海高原花斑裸鲤苗种池塘规模化培育技术

花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)是青海重要的土著鱼类,也是开展黄河流域增殖放流的重要鱼类之一。为给增殖放流提供持续的种质资源,研究和总结了近年来在青海高原条件下花斑裸鲤苗种池塘规模化培育的设施条件、饲料投喂、日常管理及鱼病防治等关键技术。

应用于花斑裸鲤增殖放流效果评价的两种标记方法对比研究

为探讨适应高原鱼类规模化增殖放流效果评价的标记方法,本研究选取黄河上游典型的规模化放流品种花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)为试验对象,对比可见植入荧光标记法和金属线码标记法标记花斑裸鲤的效果。结果显示:可见植入荧光标记的保持率是100%,死亡率3%,金属线码标记的保持率是85%,死亡率17%;单人标记速度可见植入荧光标记法大约是金属线码标记法的3倍;两种方法标记鱼类与未标记鱼类的体长体重均没有显著差异。3年的回捕监测显示,两种标记均可长期保留。鉴于可见植入荧光标记检测方法较金属线码标记保持率高,标记更为快捷,且检出率高,建议对高原鱼类的增殖放流效果评价采用可见植入荧光标记。

花斑裸鲤在3种环境中的驯化养殖试验

首次报道了黄河上游特有鱼类花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)在池塘、流水池、网箱中人工驯化养殖试验情况。395g/尾的花斑裸鲤855尾,经过170d的池塘驯养,成活778尾,驯养成活率91.0%,均重450g/尾,平均增重55g/尾,增重率13.9%;378g/尾的花斑裸鲤405尾,经过180d的流水池驯养,均重530g/尾,平均增重152g/尾,增重率40.2%,成活308尾,驯养成活率76.0%;345g/尾的花斑裸鲤2029尾,经过14个月的网箱驯养,均重500g/尾,平均增重155g/尾,增重率44.9%,成活1002尾,驯养成活率49.4%。野生花斑裸鲤驯养试验平均总成活率为72.1%。寄生虫病是导致花斑裸鲤成活率偏低的主要原因。驯养试验对黄河上游土著鱼类的人工繁育和增殖保护具有一定的借鉴意义。

青海湖裸鲤与花斑裸鲤肌肉理化特性比较

分析青海湖裸鲤、循化(人工养殖)、扎陵湖花斑裸鲤的主要营养成分和物理学指标。结果表明,循化花斑裸鲤肌肉的蛋白质、脂肪、灰分含量最高。扎陵湖花斑裸鲤肌肉水分含量高于循化花斑裸鲤和青海湖裸鲤。物理学指标成分测定结果表明,青海湖的裸鲤肉色亮度高于其它2个地区,扎陵湖花斑裸鲤肉色中的黄度、红度最高。扎陵湖花斑裸鲤系水力明显高于循化和青海湖裸鲤。青海湖裸鲤嫩度高于其它2个地区花斑裸鲤肌肉嫩度。扎陵湖的花斑裸鲤肌纤维直径为高于循化花斑裸鲤和青海湖的裸鲤,循化的花斑裸鲤肌肉纤维密度高于扎陵湖的花斑裸鲤肌纤维密度。通过与四大家鱼比较,表明人工饲养的循化花斑裸鲤是一种营养价值较高的经济鱼类。

饲养与野生生长的花斑裸鲤肌肉氨基酸分析

以青海湖裸鲤为对照,研究循化(海拔2 300 m)、扎陵湖(海拔4 294 m)花斑裸鲤肌肉氨基酸含量,样品取自青海省玛多县内扎陵淡水湖泊、循化县境内苏只水电站黄河鱼类增殖站网箱的人工养殖花斑裸鲤。结果显示,扎陵湖花斑裸鲤干样中17种氨基酸总含量(83.59 g/100 g),7种人体必需氨基酸含量(34.45 g/100 g),以及4种呈味氨基酸含量(30.54 g/100 g)均高于循化花斑裸鲤与青海湖裸鲤,以上差异均不显著(P>0.05);扎陵湖花斑裸鲤肌肉的氨基酸评分(ASS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)均高于其余循化花斑裸鲤与青海湖裸鲤,其中,必需氨基酸指数分别是青海湖裸鲤的1.4倍及循化花斑裸鲤的1.38倍。花斑裸鲤的营养价值高于现有报道的淡水鱼类,因此,花斑裸鲤营养价值最高,具备非常好的开发前景。

花斑裸鲤和极边扁咽齿鱼肌肉营养成分分析

试验结果显示,花斑裸鲤和极边扁咽齿鱼鱼体粗蛋白含量分别为60.5%和56.4%[质量(干)百分率],略低于常规鱼类;每克干物质所含必需氨基酸总量分别为34.99 mg和32.62 mg,占氨基酸总量的50.4%和52.4%,各类氨基酸较为全面,赖氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸含量最高,具有良好的利用价值。

黄河上游花斑裸鲤Cyt b基因的序列变异和遗传多样性

花斑裸鲤(Gymncypris eckloni)主要分布于黄河上游高原宽谷河段深水缓流处或静水湖泊中,在高原淡水生态系统的食物链中具有重要的地位。本文获得了黄河上游花斑裸鲤5个种群共68个个体线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b基因的全序列(1140bp),分析了序列变异和种群遗传多样性。68个序列经比对后,发现30个(2.63%)多态性位点,共定义了18个单倍型。结果显示,花斑裸鲤种群单倍型多样度和核苷酸多样度均低于其它鲤科鱼类,这可能与青藏高原经所经历的地质变迁和古气候环境的改变有关,由此生活在高原水域中的鱼类或多或少经历过瓶颈效应。AMOVA分析结果显示,遗传差异主要发生在种群之内,而不是来自不同地理组群间或组群内种群间。单倍型网络图和系统发育分析均没有显示出单倍型与地理位置的对应关系,提示黄河上游花斑裸鲤自然种群未出现分化,应作为一个整体进行保护。单倍型歧点分布呈现为单峰以及中性检验Fu’sFs(-15.3400,P<0.001)和Tajima’sD(-0.6254,P=0.3080)结果综合表明,花斑裸鲤可能经历过近期的种群扩张事件。

黄河花斑裸鲤肌肉中矿物质元素测定与营养评价

花斑裸鲤Gymnocypris eckloni是我国重要的水生野生动物资源,青海省级保护鱼类。本研究分析比较了人工养殖和天然生长的黄河花斑裸鲤肌肉中的8种矿物质元素(K、Na、Ca、Fe、Zn、Mn、Cu和Mg)和4种重金属元素(Hg、As、Pb和Cd)的含量。结果表明:除了Zn、Mn以外,人工养殖黄河花斑裸鲤肌肉中K、Na、Ca、Fe、Cu和Mg的含量均等于或大于天然生长的,差异不显著。人工养殖和天然生长的黄河花斑裸鲤肌肉中4种重金属含量都符合国标要求。人工养殖黄河花斑裸鲤肌肉中Hg和Pb的含量小于天然生长的,但是As和Cd的含量稍大于天然生长的。结合先前的研究表明,人工养殖的花斑裸鲤肌肉品质和自然生长的花斑裸鲤没有显著的差异,花斑裸鲤具有较大的开发利用前景。

人工养殖花斑裸鲤氨基酸组成及营养价值评价

采用氨基酸自动分析仪对人工养殖花斑裸鲤肌肉中氨基酸成分和含量进行测定,并对其营养价值进行综合评价。结果表明:人工养殖花斑裸鲤肌肉中蛋白质的氨基酸组成非常全面,含18种氨基酸,其中包括人体必需的8种氨基酸。其中总氨基酸、人体必需氨基酸及味觉氨基酸的含量较高,分别为75.9,31.40和48.38g/100g干重。除色氨酸外,人工养殖花斑裸鲤必需氨基酸的AAS均大于0.80,CS均大于0.60。人工养殖花斑裸鲤的必需氨基酸指数(EAAI)为63.25。

花斑裸鲤的人工繁殖试验

于2015年4月在四川省凉山科华水生态工程有限公司水产良种场使用LRH-A2+DOM分2批对来自黄河水系的24尾(以雌鱼计)野生花斑裸鲤亲鱼进行人工催产。雌鱼在挤卵前死亡5尾,1尾未产卵,平均催产率为75.5%;18尾雌鱼共产卵14.3万粒,受精卵13.1万粒,受精率为91.6%;获初孵仔鱼10.2万尾,孵化率77.9%。研究结果表明,在非产区进行花斑裸人工繁殖是可行的。

2种裸鲤线粒体DNA细胞色素b基因序列分析

对青海湖裸鲤和花斑裸鲤的线粒体DNA细胞色素b基因进行了PCR扩增、克隆及其序列测定,得到的序列长度均为1140bp,但T,C,A,G含量有所不同。在青海湖裸鲤细胞色素b基因中它们的含量分别为355(31.1%),296(26%),305(26.8%)和184(16.1%),GC含量为42.1%,分子量为349693道尔顿(Dalton);在花斑裸鲤细胞色素b基因中,它们的含量分别为358(31.4%),294(25.8%),305(26.8%)和183(16.1%),GC含量为41.8%,分子量为349698道尔顿(Dalton)。

青海湖裸鲤和花斑裸鲤消化酶活力对比

本实验对比研究青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)和花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)消化酶活性差异。两种鱼各挑选9尾体重100g左右的鱼作为实验对象,分别检测肝胰脏、前肠、中肠及后肠中的脂肪酶、淀粉酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶活性。结果表明:作为无胃鱼,两种鱼肠道消化酶活性显著高于肝胰脏,其中前肠是主要的消化器官,后肠具有较高的蛋白质消化能力。通过对比研究发现青海湖裸鲤具有较高的脂肪和糖类消化能力,而花斑裸鲤具有较高的蛋白质消化能力。

花斑裸鲤卵黄囊期仔鱼的发育观察

对花斑裸鲤卵黄囊期仔鱼的发育过程进行观察,结果表明:水温14-16℃,p H6.1-7.1,溶氧6.6-7.6 mg/L的条件下花斑裸鲤刚刚孵化的仔鱼全长8.02-8.31 mm,身体淡黄色,沉于水底,依靠卵黄囊提供能量;孵化后第4天,仔鱼背鳍原基开始分化,身体背部、肌节和卵黄囊之间出现大量点状黑色素斑;孵化后第6天仔鱼开始平游,并开口摄食,全长达到11.93-12.46 mm;第11天卵黄囊基本消失,仔鱼依靠外源性营养进行生长发育,全长达到14.41-15.02 mm。

几何形态测量法结合Micro CT扫描对两水系花斑裸鲤的形态分析

研究采用现代几何形态测量法并结合Micro CT扫描技术对两水系(黄河上游与柴达木水系格尔木河)花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni Herzenstein)的形态进行定量分析,讨论两水系花斑裸鲤是否存在先前研究未能发现的形态差异。结果显示:花斑裸鲤的两个地理种群在基于其头部形态轮廓二维坐标的主成分分析和判别分析的结果均聚在一起,这与之前文献记载的两水系花斑裸鲤的形态学特征相一致,并且对两水系花斑裸鲤进行的典型变量分析也同样支持这一结果;对花斑裸鲤两个地理种群背鳍支鳍骨插入椎骨间的相对位置这一形态特征进行卡方检验,结果表明在骨骼这一更具分类学意义的形态特征上表现出显著性差异。通过对花斑裸鲤两个地理种群的几何形态与Micro CT扫描,准确定量地分析了两水系花斑裸鲤形态上的异同,为正确评价两水系花斑裸鲤真实的演化关系奠定了形态学基础。

Zn2+胁迫对花斑裸鲤抗氧化关键基因表达和抗氧化酶活性的影响

为探讨水体Zn2+对鱼类的影响,并筛选出有效的生物标记物,以花斑裸鲤Gymnocypris eckloni幼鱼(体质量为10 g±3 g)为试验对象,分别以1、2、5、10、20 mg/L Zn2+为胁迫浓度,计算24、48、72、96 h时的半致死浓度(LD50),经1 mg/L Zn2+胁迫12、24、48、72、96 h后,采用qPCR技术检测鳃、肾脏和肝脏组织中抗氧化防御系统相关的核因子E2相关因子2(Nrf2)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)基因表达量变化,以热图分析各基因在3种组织中的应答层次,以及用吸光度法测定SOD、CAT和GPx抗氧化酶活性的变化。结果表明:Zn2+对花斑裸鲤幼鱼胁迫24、48、72、96 h时的半致死浓度(LD50)分别为5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L,安全浓度为0.2 mg/L;在Zn2+胁迫96 h内,花斑裸鲤Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因表达量及SOD、CAT和GPx酶活性均有不同程度的升高,但升高幅度各异;基因表达量热图分析显示,与鳃、肾脏和肝脏组织中Nrf2的4个下游基因表达量相比,Nrf2表达量相对较低,尤其在肾脏和肝脏组织中表现更为明显。研究表明,花斑裸鲤Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因表达量及相关酶活性与Zn2+胁迫存在一定的时间相关性和组织特异性,其可作为预警水体Zn2+污染的备选生物标记物。