青海湖盐单胞菌QHL1 ectABC基因簇克隆鉴定及二氨基丁酸转氨酶基因ectB的异源表达

从青海湖20份水样筛选得到一株优势中度嗜盐菌QHL1,经初步鉴定为盐单胞菌属。设计保守基因ectB的引物,以基因组DNA为模板,PCR扩增获得ectB基因(1269 bp)。利用染色体步移技术,克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC及其上下游调控序列。DNAStar软件分析表明ectA、ectB和ectC位于同一个操纵子上,大小分别为579 bp、1269 bp和390 bp,预测分别编码192、422和129个氨基酸的肽链。同源性分析表明:Halomonas sp.QHL1ectABC基因簇所编码的二氨基丁酸转乙酰基酶(EctA)、二氨基丁酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合成酶(EctC)与Halomonas sp.Nj223 ectABC基因簇所编码的酶蛋白相似性分别达57%、96%和85%。利用分子克隆技术构建二氨基丁酸转氨酶基因ectB的重组表达载体pET-28-ectB,通过限制性内切酶酶切和测序分析,结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确。诱导表达重组菌,SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约46 kDa。

新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中四氢嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及其功能鉴定

研究旨在克隆新的四氢嘧啶合成基因簇,并对其功能进行鉴定,为应用于四氢嘧啶的生产奠定基础。从新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2中克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC,ectABC与表达载体pBAD连接后转化至大肠杆菌BW25113中,通过L-阿拉伯糖诱导表达。采用SDS-PAGE和液质联用鉴定重组表达蛋白,利用全细胞催化合成四氢嘧啶,通过高分辨质谱鉴定四氢嘧啶,并从天冬氨酸浓度、KCl浓度、温度和pH 4个方面优化催化条件。结果表明,来自新喀里多尼亚弧菌CGJ02-2基因组的ectABC大小为2235 bp。SDS-PAGE显示表达产物中有3个重组蛋白产生,液质联用鉴定表明其分子量分别与ectA、ectB、ectC的理论分子量一致。高分辨质谱分析发现全细胞催化上清中有四氢嘧啶产生。优化后的最适全细胞催化条件为:天冬氨酸浓度100 mmol·L^(-1),KCl浓度100 mmol·L^(-1),温度30℃,pH 7.0,最优条件下产量为1.11 mg·mL^(-1)。研究从弧菌中克隆了四氢嘧啶合成基因簇ectABC,并在大肠杆菌BW25113中实现了异源表达和低盐环境下的四氢嘧啶合成,为大规模发酵生产四氢嘧啶奠定了基础。

Halomonas sp.QHL1四氢嘧啶合成基因簇ectABC与上游调控序列的克隆及其功能分析

目的克隆中度嗜盐菌Halomonas sp.QHL1中的四氢嘧啶合成基因簇及上游调控序列并进行功能分析。方法通过PCR技术从Halomonas sp.QHL1中克隆获得ectABC基因簇及上游启动子序列(promoter+ectABC),将其与表达载体pColdⅠDNA连接,转化至E.coil BL21(DE3),用SDS-PAGE分析目的基因的异源表达、盐耐受实验检测重组菌株的耐盐能力。结果克隆得到大小为3335 bp的promoter+ectABC基因序列,并在E.coil BL21(DE3)中成功异源表达,重组菌株盐耐受能力明显提高。结论四氢嘧啶生物合成基因操纵子序列能够在E.coil BL21(DE3)中异源表达,且含有该序列的工程菌株耐盐能力显著提高。

密旋链霉菌Act12中四氢嘧啶合成基因簇的鉴定及其功能分析

【目的】对生防密旋链霉菌Act12中的四氢嘧啶合成基因簇进行鉴定及功能分析。【方法】对田间生防效果良好的密旋链霉菌Act12进行盐耐受能力检测,采用体积分数80%的乙醇抽提其胞内四氢嘧啶,分别通过TLC和HPLC进行定性及定量检测四氢嘧啶。通过Act12全基因组分析,克隆得到Act12中四氢嘧啶生物合成基因簇ectABC,将其与表达载体pET-28a连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,检测工程菌株的盐耐受能力。【结果】密旋链霉菌Act12可在NaCl质量分数为0%~10.0%的条件下生长,且能够生产相关耐盐相容性溶质四氢嘧啶。当NaCl质量分数为2.5%时,密旋链霉菌Act12胞内的四氢嘧啶积累量达到最大值,为72.39mg/L。生物信息学分析结果表明,组成ectABC基因簇的3个基因ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,分别编码二氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶。通过克隆得到长2 408bp的ectABC基因簇,并使其成功在大肠杆菌中实现异源表达,通过Ni柱纯化得到了EctA蛋白。但含pET28a-ectABC的大肠杆菌BL21(DE3)在本试验条件下,其盐耐受能力并无明显改善。【结论】生防链霉菌Act12中存在四氢嘧啶合成基因簇ectABC,且能够在大肠杆菌中成功异源表达。