lncRNA HAND2-AS1通过调节miR-21表达对子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞迁移和侵袭的抑制作用

目的:探讨子宫内膜异位症(EMT)患者子宫内膜组织中长链非编码RNAs(lncRNAs)HAND2-AS1对异位子宫内膜(EC)组织中子宫内膜基质细胞(ESCs)增殖、迁移和侵袭能力的影响,并阐明其可能机制。方法:收集30例EMT患者(EMT组)的EC组织和30例健康育龄女性(对照组)的子宫内膜组织,分离子宫内膜组织获取ESCs。采用脂质体转染法转染EMT患者EC组织的ESCs,并将ESCs分为pcDNA组(转染pcDNA空质粒)、HAND2-AS1组(转染HAND2-AS1过表达质粒)、mimic NC组(转染mimic NC)、miR-21 mimic组(转染miR-21 mimic)、pcDNA+mimic NC组(联合转染pcDNA和mimic NC)、HAND2-AS1+mimic NC组(联合转染HAND2-AS1过表达质粒和mimic NC)、pcDNA+miR-21 mimic组(联合转染pcDNA空质粒和miR-21 mimic)和HAND2-AS1+miR-21 mimic组(联合转染HAND2-AS1过表达质粒和miR-21 mimic),另设未转染的细胞为空白对照组。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组研究对象子宫内膜组织和ESCs中HAND2-AS1 mRNA和miR-21表达水平,采用Pearson相关系数分析其相关性。采用生物信息学软件Starbase预测lncRNA HAND2-AS1与miR-21的靶向作用关系,荧光素酶基因报告实验进行验证。CCK-8法检测各组ESCs增殖活性,Transwell小室实验检测ESCs的迁移和侵袭数。结果:2组研究对象年龄、体质量指数(BMI)和血清中卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)及催乳素(PRL)水平比较差异均无统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,EMT组患者血清中雌二醇(E2)水平升高(P<0.05),EMT组患者EC组织中HAND2-AS1 mRNA表达水平降低(P<0.05),miR-21表达水平升高(P<0.05);与对照组比较,EMT组ESCs中HAND2-AS1 mRNA表达水平降低(P<0.05),miR-21表达水平明显升高(P<0.01)。Pearson相关系数分析,对照组研究对象HAND2-AS1与miR-21表达水平无明显相关性(r=0.34,P>0.05),EMT组患者ES组织中和ESCs中HAND2-AS1与miR-21表达水平呈负相关关系(r=-0.57,P<0.05)。RT-qPCR法检测,与空白对照组比较,HAND2-AS1组ESCs中HAND2-AS1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),miR-21 mimic组ESCs中miR-21表达水平明显升高(P<0.01),HAND2-AS1+mimic NC组ESCs中miR-21表达水平降低(P<0.05),pcDNA+miR-21 mimic组ESCs中miR-21表达水平明显升高(P<0.01);与pcDNA+miR-21 mimic组比较,HAND2-AS1+miR-21 mimic组ESCs中miR-21表达水平降低(P<0.05)。lncRNA HAND2-AS1与miR-21存在潜在结合位点;双荧光素酶基因报告实验,与mimic NC组比较,miR-21 mimic组HAND2-AS1-WT中荧光素酶活性明显降低(P<0.01)。与空白对照组比较,HAND2-AS1+mimic NC组ESCs增殖活性、迁移和侵袭数均明显降低(P<0.05或P<0.01),pcDNA+miR-21 mimic组ESCs增殖活性、迁移和侵袭数升高(P<0.05);与pcDNA+miR-21 mimic组比较,HAND2-AS1+miR-21 mimic组ESCs增殖活性、迁移和侵袭数均降低(P<0.05)。结论:HAND2-AS1在EMT患者EC组织和ESCs中表达明显降低,其可通过靶向抑制miR-21表达下调EC组织中ESCs的增殖、迁移和侵袭,从而参与EMT的发生发展。

GnRHa对离体培养异位、在位内膜间质细胞生长抑制及分泌VEGF的影响

目的研究GnRHa对子宫内膜异位症(简称内异症)患者离体培养异位、在位子宫内膜间质细胞生长抑制及分泌VEGF的影响。方法体外原代培养人内异症异位、在位子宫内膜间质细胞,用10-10M、10-8M和10-6M的GnRHa分别干预,用MTT法测定内膜间质细胞的生长增殖情况;用ELISA法测定其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)浓度的变化。结果 GnRHa可抑制内异症异位及在位内膜间质细胞的生长增殖,呈剂量和时间依赖性(P<0.05),且对异位内膜间质细胞生长的抑制率明显高于在位(P<0.05);GnRHa可降低异位及在位内膜间质细胞分泌的VEGF的浓度,呈剂量依赖性(P<0.05),且高浓度(10-6M)对异位强于在位(P<0.05)。结论 GnRHa可明显抑制子宫内膜异位症患者异位、在位子宫内膜间质细胞的生长,降低其分泌VEGF的浓度。

莪术醇对子宫腺肌症异位子宫内膜间质细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的探讨莪术醇对子宫腺肌症异位子宫内膜间质细胞(EESCs)细胞增殖、凋亡及迁移的影响,为临床治疗子宫腺肌症提供理论依据。方法对EESCs进行分离、纯化培养及细胞鉴定。将传至第2—3代的EESCs细胞随机分为5组:Control组(加入质量浓度为10 mg·L-1的无水乙醇作用于EESCs)和莪术醇1、2、3、4组(分别加入质量浓度为12.50、25.00、50.00、100.00 mg·L-1的莪术醇作用于EESCs)。采用CCK-8法检测EESCs的细胞存活率,细胞划痕实验检测EESCs的细胞迁移率,流式细胞术联合FITC-Annexin V/PI双染色法检测EESCs的细胞凋亡率。结果分别用鼠抗人vimentin、cytokine抗体鉴定EESCs显示细胞纯度在95%以上,成功分离培养出原代EESCs细胞。与Control组比较,莪术醇1、2、3、4组24、48 h时EESCs细胞增殖率、24 h EESCs细胞迁移率均降低,EESCs细胞凋亡率均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。莪术醇1、2、3、4组24、48及72 h时EESCs细胞增殖率均低于96 h,莪术醇3、4组EESCs细胞凋亡率均较莪术醇1、2组升高,莪术醇4组EESCs细胞凋亡率较莪术醇3组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论莪术醇在体外能显著抑制子宫腺肌症EESCs细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,具有潜在的治疗子宫腺肌症作用。

GnRHa对子宫内膜异位症内膜间质细胞生长增殖及血管形成的影响

目的:研究GnRHa对子宫内膜异位症异位及在位内膜间质细胞增殖、凋亡及血管形成的影响。方法:体外原代培养人内异症异位及在位子宫内膜间质细胞,用不同浓度的GnRHa分别干预,四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法测定内膜间质细胞的生长增殖活力;Annexin V-FITC和PI双染、流式细胞仪(FCM)检测异位及在位内膜间质细胞凋亡及周期变化;免疫细胞化学检测血管内皮生长因子(VEGF)表达的改变。结果:GnRHa可抑制内异症异位及在位内膜间质细胞增殖且呈剂量依赖关系;GnRHa能明显增加异位及在位内膜细胞的凋亡率(P<0.05),且异位内膜细胞凋亡率明显高于在位内膜(P<0.05);不同浓度的GnRHa作用后,内膜间质细胞均发生细胞周期阻滞,G1期细胞增加,S期细胞减少,此作用随浓度增加而增强(P<0.05);免疫细胞化学测定表明,GnRHa可降低异位及在位内膜间质细胞VEGF的表达(P<0.05),且随GnRHa浓度增加而增强(P<0.05)。结论:GnRHa可明显抑制人内异症异位及在位子宫内膜间质细胞的生长并促进其凋亡,降低异位及在位内膜间质细胞VEGF的表达。

榆栀止血颗粒含药血清对异位子宫内膜间质细胞PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响

目的:探讨榆栀止血颗粒含药血清对异位子宫内膜间质细胞(ESCs)中第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响。方法:制备榆栀止血颗粒含药血清,体外培养人异位ESCs细胞,分为对照组(空白血清)、低剂量组(榆栀止血颗粒低剂量血清)、中剂量组(榆栀止血颗粒中剂量血清)和高剂量组(榆栀止血颗粒高剂量血清)。CCK-8法检测细胞增殖情况;Transwell法检测细胞侵袭情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞中PTEN mRNA表达情况;蛋白印迹(WB)法检测细胞中PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达情况。结果:与对照组相比,低、中、高剂量组异位ESCs细胞OD值、侵袭细胞数、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞中PTEN mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);随着榆栀止血颗粒含药血清剂量升高,异位ESCs细胞OD值、侵袭细胞数、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平逐步递减(P<0.05),细胞中PTEN mRNA及蛋白表达水平逐步递增(P<0.05)。结论:榆栀止血颗粒含药血清可抑制异位ESCs细胞增殖与侵袭,上调PTEN表达并抑制PI3K/AKT信号通路。

依西美坦对异位子宫内膜间质细胞caspase-3表达的影响和意义

目的探讨芳香化酶抑制剂依西美坦对异位子宫内膜间质细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达的影响及其临床意义。方法体外培养正常和异位子宫内膜间质细胞.应用RT-PCR检测芳香化酶mRNA的表达.用SABC免疫组织化学法检测caspase-3的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果与正常内膜间质细胞相比,异位内膜间质细胞可以利用芳香化酶合成雌激素,caspase-3表达和细胞凋亡减少(P均<0.05);依西美坦灭活芳香化酶,降低雌激素水平,caspase-3表达和细胞凋亡升高(P均<0.05);反向添加雌激素可阻断依西美坦的作用。结论caspase-3调控异位内膜间质细胞的凋亡;依西美坦增加caspase-3的表达,促进异位内膜间质细胞凋亡。

依西美坦对异位子宫内膜间质细胞β-内啡肽表达的影响和意义

目的:探讨β-内啡肽对异位子宫内膜间质细胞凋亡的影响和芳香化酶抑制剂依西美坦的作用。方法:应用发光免疫法检测雌二醇的水平;应用免疫组织化学法检测β-内啡肽的表达;应用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果:与正常内膜间质细胞相比,异位间质细胞可以合成雌激素,β-内啡肽的表达较低,凋亡率较低(P<0.05);依西美坦作用72 h后,异位间质细胞雌激素合成减少,β-内啡肽的表达增加,凋亡率升高(P<0.05);反向添加雌二醇后,异位间质细胞的β-内啡肽和凋亡率与异位间质细胞对照组无明显差异(P>0.05)。结论:β-内啡肽与异位子宫内膜间质细胞的凋亡有关,依西美坦经降调β-内啡肽的表达而增加异位内膜间质细胞的凋亡,反加雌激素可以阻断这一作用。

NO/ET对异位子宫内膜间质细胞凋亡的影响

目的 :探讨NO和ET对异位子宫内膜间质细胞凋亡的影响。方法 :体外培养原位和异位子宫内膜间质细胞 ,应用ELISA检测内皮素表达 ,用硝酸还原酶法检测一氧化氮 ,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果 :与原位子宫内膜间质细胞相比 ,异位子宫内膜间质细胞NO和ET的合成增加 ,NO/ET比值下降 ,细胞凋亡率降低(P <0 .0 5 )。结论 :NO和ET单独应用时都不可能很好的解释异位子宫内膜间质细胞的凋亡 ,NO/ET比值可理想的解释这两个因子对细胞凋亡的影响。

减味二藤汤对宫腔机械性损伤大鼠子宫内膜基质细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α/脂肪酸氧化信号通路的影响

【目的】在细胞水平探讨减味二藤汤(红藤、忍冬藤等组成)对宫腔机械性损伤所致宫腔粘连的治疗作用机制。【方法】对宫腔机械性损伤所致宫腔粘连大鼠及正常大鼠的子宫内膜基质细胞(ESCs)进行体外原代培养,所培养的细胞进行免疫荧光染色法鉴定,共分为正常组、模型组、减味二藤汤含药血清组、空白血清组、拮抗剂组[减味二藤汤含药血清+过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)抑制剂GW6471],其中,正常组为正常大鼠来源的ESCs,其余各组为宫腔粘连大鼠来源的ESCs。各组细胞处理48 h后,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法观察细胞活性,采用Western Blot法检测各组细胞PPAR-α、酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)及纤连蛋白(Fibronectin)的表达。【结果】与空白血清组和拮抗剂组比较,减味二藤汤含药血清组细胞活性下降,α-SMA、Collagen I、Fibronectin的蛋白表达水平降低(P<0.05),PPAR-α、ACOX1、CPT1A的蛋白表达水平升高(P<0.05)。【结论】减味二藤汤可激活PPAR-α/脂肪酸氧化(FAO)通路,促进脂肪酸氧化,从而改善宫腔机械性损伤引起的宫腔粘连纤维化。

基于JAK2/STAT3信号通路探讨三棱-莪术含药血清对人异位子宫内膜间质细胞增殖、凋亡和迁移的影响

基于酪氨酸蛋白激酶(Janus kinase, JAK)2/信号传导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)3信号通路,研究三棱-莪术含药血清对异位的子宫内膜间质细胞(ectopic endometrial stromal cells, ESCs)增殖、凋亡、迁移和炎症因子分泌的影响。原代培养ESCs,噻唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)检测不同质量分数(5%、10%、20%)三棱、莪术、两药配伍的含药血清和AG490溶液(50μmol·L^(-1))对ESCs增殖的影响,并由此选择最优剂量用于后续实验;将细胞分为空白血清组、三棱组(10%)、莪术组(10%)、配伍组(10%)和AG490组,以流式细胞术检测ESCs凋亡水平,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α分泌水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)-3、B淋巴细胞瘤(B-cell lymphoma, Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)的蛋白表达以及JAK2、STAT3蛋白的磷酸化水平。结果显示,与空白血清组相比,各给药组均能使ESCs的活力显著降低(P<0.01),尤其10%含药血清细胞活力低于其他组,因此后续实验采用10%的含药血清进行观察。10%的三棱、莪术和两药配伍的含药血清均能使细胞凋亡率显著增加(P<0.01),细胞中caspase-3和Bax蛋白表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),细胞迁移率显著降低(P<0.05或P<0.01),细胞分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α显著减少(P<0.05或P<0.01),JAK2和STAT3的磷酸化水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。与三棱、莪术组相比,10%配伍组含药血清孵育后细胞活力更低(P<0.01),caspase-3和Bax蛋白表达较高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2蛋白表达更低(P<0.05),JAK2蛋白磷酸化程度较低(P<0.05)。10%配伍组含药血清孵育后,细胞凋亡率明显高于莪术组(P<0.05),细胞的迁移率明显低于莪术组(P<0.01),对STAT3蛋白磷酸化的抑制作用明显强于三棱组(P<0.05)。三棱、莪术及其配伍应用改善子宫内膜异位症的作用机制可能与阻断JAK2/STAT3信号通路,抑制ESCs增殖,促进细胞凋亡,减弱其迁移能力,减少炎症因子的分泌有关,并且三棱-莪术等比配伍效果优于两药单用。

桂枝茯苓胶囊对内膜异位症患者异位内膜间质细胞增殖及Ang-2水平的影响

目的 探讨桂枝茯苓胶囊对内膜异位症（EM）患者异位内膜间质细胞增殖及促血管生成素-2（Ang-2）水平的影响.方法 将120例EM患者随机分为观察组与对照组,每组60例,对照组患者给予妈富隆（1片/d）联合达菲林（8 mg/d）治疗,观察组在对照组的基础上给予桂枝茯苓胶囊（3粒/次,3次/d）治疗,治疗时间为6个月,对比分析两组患者的治疗效果.分别于治疗前后应用MTT法测定两组间质细胞生长抑制率,应用ELISA法测定两组间质细胞分泌的Ang-2水平.结果 观察组总有效率为96.67%,对照组为83.33%,差异有统计学意义（P〈0.05）.两组治疗后总盆腔体症评分、总阳性体征评分、总主观体征评分显著低于治疗前,且观察组治疗后症状评分低于对照组（P〈0.05）.观察组治疗后异位内膜间质细胞吸光值（OD）值及Ang-2水平低于对照组（P〈0.05）.结论 桂枝茯苓胶囊能有效抑制内膜间质细胞增殖及Ang-2分泌,改善患者临床症状,提高治疗效果.

子宫内膜蜕膜化过程的调节机制

子宫内膜蜕膜化是胚泡植入、胎盘形成以及妊娠维持的必备条件之一。蜕膜化时,子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)在形态和功能上都发生明显改变。生理情况下,ESCs主要受卵巢雌、孕激素的影响向蜕膜间质细胞转化;在体外实验中,多种细胞因子、激素、免疫细胞、转录因子等都参与调节ESCs模拟蜕膜化过程,有利于人们对蜕膜化机制的理解。

激活素A对子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞的调节作用

目的:探讨激活素A(activin A)对子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)患者在位子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)活性的调节作用。方法:分别用RT-PCR和Real-timePCR的方法检测5例正常、45例EMs在位、异位组织中激活素AβA亚基和芳香化酶CYP19A1mRNA的表达。分离培养5例正常、5例EMs在位、异位组织ESCs,用不同剂量的激活素A刺激EMs在位ESCs不同时间后,应用免疫电化学发光法检测ESCs分泌雌二醇(E2)的水平,MTT检测ESCs活性,流式细胞仪检测ESCs凋亡和细胞周期。结果:激活素AβA亚基在EMs异位ESCs的表达明显高于正常对照ESCs和EMs在位ESCs。经25 ng/ml激活素A刺激24 h后,与正常对照组相比,在位ESCs的E2分泌和芳香化酶CYP19A1mRNA的表达均显著升高。但激活素A未引起ESCs增殖活性的显著变化,对细胞凋亡和细胞周期亦无影响。结论:激活素A可能通过促进芳香化酶表达而增加ESCs的E2分泌,这可能是EMs异位灶存活和病理发生的机制之一。