粪肠球菌心内膜抗原efaA基因转化株的构建及其对生物膜形成的影响

目的构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株,探讨efaA基因在肠球菌生物膜形成及感染性心内膜炎致病中的作用。方法 PCR扩增粪肠球菌efaA基因,构建pAT28-efaA重组子,经PCR、双酶切及测序鉴定,将重组子转化到efaA-野生株S14做为转化株(S14-pAT28-efaA);同时将空质粒pAT28转化到野生株作为对照株(S14-pAT28);IPTG诱导efaA表达,SDS-PAGE、Western Blot分析鉴定。微量滴定板法测定生物膜形成能力。将S14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37℃培养24h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部在595nm的OD值,比较efaA基因转化前后的生物膜形成能力。结果成功构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株;转化株的OD595值大于野生株及空质粒转化株,P<0.05,空质粒转化株的OD595值与野生株比较差异无统计学意义,P>0.05。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。

粪肠球菌心内膜炎抗原EfaA在生物膜形成中的作用

目的探讨粪肠球菌心内膜炎抗原EfaA在生物膜形成中的作用。方法微量滴定板法测定生物膜形成能力,将efaA+、efaA-粪肠球菌S14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37℃培养24h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部生物膜的OD570值;MTT法比较S14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA所形成的生物膜的活菌含量OD492;共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察比较efaA+、efaA-肠球菌形成的生物膜的平均厚度、最大厚度。结果 efaA+转化株在各培养时间点微量滴定板法测定的生物膜形成能力OD570值、MTT法测定的OD492活菌含量、CLSM观察的生物膜的平均厚度、最大厚度均大于野生株及空质粒转化株,P<0.05;空质粒转化株与野生株比较无显著性差别,P>0.05。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。

东北黑熊源粪肠球菌EfaA基因的克隆表达及生物信息学分析

为检测熊源粪肠球菌心内膜炎抗原(EfaA)基因,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,本试验根据GenBank登录的粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756.1)合成了1对PCR引物,通过PCR法扩增合成长度为689bp的目的片段。将PCR产物克隆于pMD19-T载体,之后将其转入大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-EfaA并进行PCR、酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果显示,本试验成功克隆出熊源粪肠球菌EfaA基因,与GenBank登录的ATCC 29212菌株同源性为100.0%。本试验成功构建了重组克隆载体pMD19-T-EfaA,并对测序结果进行了蛋白质结构的预测,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供了理论依据,同时也为黑熊疾病的防制奠定了基础。