布鲁氏菌效应蛋白BspH部分生物信息学分析及与其互作宿主蛋白的筛选

为分析BspH蛋白的部分分子生物信息学及与其互作的宿主蛋白,本研究通过在线软件Predicting Antigenic Peptides分析BspH蛋白的抗原决定簇、SWISS MODEL预测BspH蛋白的三级结构。委托公司合成BspH基因并构建重组表达质粒pET-B2m-BspH,经酶切和测序鉴定正确后,将pET-B2m-BspH转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达重组BspH蛋白(rBspH),利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白,并经SDS-PAGE检测。将纯化的rBspH免疫日本大耳兔4次,4免后1周即首免后49 d采血分离血清制备BspH蛋白多克隆抗体(PAb)并经ELISA检测其效价,采用western blot检测该PAb与BspH蛋白的反应性。预测结果显示,BspH蛋白有19个抗原决定簇,三级结构以α-螺旋为主。SDS-PAGE结果显示,在65 ku处出现目的条带,且rBspH主要以包涵体的形式表达,纯化效果较好。ELISA和western blot结果显示,制备的PAb效价为1:1024000,且该PAb可以与纯化的rBspH反应,在65 ku处出现特异性条带。将委托公司构建的重组诱饵质粒pGBKT7-BspH和pGADT7共转化酵母菌感受态细胞,30℃培养3 d~5 d后上述转化的酵母菌在DDO/X培养板上长出蓝色菌落,表明p GBKT7-BspH质粒已转入酵母菌中,且表达了诱饵蛋白BspH;在TDO/X和QDO/X/A培养板上均不生长,且在DDO/X培养板上形成的菌落大小和数量与阴性对照酵母菌基本一致,表明诱饵蛋白BspH在酵母菌中无自激活活性和毒性。在此基础上,将pGBKT7-BspH和小鼠RAW264.7细胞cDNA文库共转化酵母菌Y2H Gold感受态细胞,以表达的BspH作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交技术从上述cDNA文库中初步鉴定与BspH存在相互作用的宿主蛋白,结果显示共有28个阳性菌落变蓝,分别提取该28个阳性菌落中的质粒并测序,将测序后的序列在NCBI数据库进行BLASTX比对分析,共得到18种同源性为88.93%~100%并能与BspH蛋白相互作用的宿主蛋白,对其中的5个宿主蛋白进一步经回交验证试验,结果显示,BspH与5个宿主蛋白AKIP1、UBXN1、HSP90AA1、PRC1、PGM1均存在互作。本研究表达并纯化了布鲁氏菌效应蛋白BspH,制备了BspH蛋白的PAb,并筛选到与BspH蛋白互作的5个宿主蛋白,为进一步探究BspH蛋白在布鲁氏菌感染中的功能及其致病机制提供参考依据。