果胶酶产生菌 Bacillus subtilis Z-5的筛选及酶学性质研究

以果胶为唯一碳源,通过透明圈法和DNS法从上海海洋大学橘园的土壤中筛选出1株高产、有良好热稳定性和酸碱耐受性的产果胶酶野生型菌株Z-5。通过16S rDNA分子技术并综合生理生化特征确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对该果胶酶进行酶学性质研究,结果表明最佳酶活性的反应温度为60℃,最佳酶活性的反应pH为6.0,在此作用温度和作用pH下,酶活力为(879±2.733)U/mL。此外,该酶在40~50℃、pH 6.0~9.0稳定性良好。Ba^(2+)、Fe^(2+)、Ca^(2+)、Cu^(2+)对该酶表现出促进作用,Zn^(2+)、Mn^(2+)对该酶表现出抑制作用。其中Cu^(2+)促进作用最强,Zn^(2+)抑制作用最强,而Mg^(2+)、Hg^(2+)对该酶无明显影响。Bacillus subtilis Z-5所产的果胶酶具有应用于食品商用果胶酶的潜力。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HW201的酶学特性及沤麻试验研究

在亚麻温水沤麻水中分离得到的一株细菌,依据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中的分类,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在该菌株产生的各类酶中,聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)的含量最丰富,并在中性及35℃的条件下显示出最大的酶活性。因此主要研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HW201在亚麻沤麻过程中应用的基础条件与效果。结果表明,沤麻液中需要补充适量氮源以促进枯草芽孢杆菌HW201的生长和繁殖;纯HW201菌能够在沤麻过程中起到脱胶作用;在试验的沤麻条件中,固液比对沤麻有比较大的影响,降低固液比后沤麻液中的微生物生长更加旺盛,明显缩短了沤麻周期,处理后的麻纤维在化学成分上与传统生产工艺基本一致。

高产淀粉酶菌株Bacillus subtilis XC2的产酶条件及酶学性质

试验研究从高产淀粉酶菌株Bacillus subtilis XC2的产酶条件及酶学性质。通过单因素试验和正交试验,初步探究淀粉酶酶学性质并优化菌株发酵产酶条件。结果表明,菌株XC2产淀粉酶的反应最适温度为50℃,最适反应pH值为6.0,在30~50℃和pH值4.0~7.0时酶活稳定性较好,Fe^(2+)、Cu^(2+)和Zn^(2+)对酶活有促进作用,Na^(+)对酶活有抑制作用。菌株XC2产淀粉酶最佳条件为蔗糖添加量1.5%、牛肉膏添加量2.0%、K^(+)添加量0.6%、培养温度37℃、转速200 r/min、初始pH值7.0、发酵时间21 h。研究表明,对产酶条件优化后,Bacillus subtilis XC2产淀粉酶活力达984.5 U/mL。

芽孢杆菌(Bacillus subtilis No.16A)苎麻脱胶聚半乳糖醛酸裂解酶的纯化及酶学性质

通过丙酮沉淀,阳离子交换层析,凝胶过滤,从苎麻脱胶菌Bacillus subtilis No.16A发酵液中纯化了聚半乳糖醛酸酶（Pgase）.结果表明该酶分子量为30.2ku,最适作用pH为9.0,最适作用温度为50℃,在55℃以下、中性pH（6.0～8.0）范围内稳定, Ca^2＋、Mg2＋对该酶有激活作用, Cu^2＋、Mn^2＋、Co^2＋、Hg^2＋有抑制作用,酶解产物在235 nm处有强吸收峰,说明该酶是聚半乳糖醛酸裂解酶.

Bacillus stearothermophilus麦芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis中的重组表达及发酵优化

为了实现Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶基因amyM(EC 3.2.1.133)在枯草芽孢杆菌中的重组表达,以opt-amyM/T质粒为模板进行PCR扩增得到目的基因,与表达载体pHY300PLK进行重组连接后转入宿主菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中进行表达。在TB培养基中发酵培养48 h,麦芽糖淀粉酶酶活达到250.7 U/mL。继续对重组菌氮源种类及复配、氮源质量浓度、碳源质量浓度等摇瓶发酵条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:复合氮源为酵母浸膏25 g/L和大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、培养基初始pH 6.5、最适培养温度41℃;在此条件下麦芽糖淀粉酶酶活可达396.7 U/mL,是优化前的1.6倍。在此基础上进一步对麦芽糖淀粉酶进行酶学性质进行测定:麦芽糖淀粉酶最适温度为60℃,最适pH为5.5,半衰期为325 h,Km为0.95 g/L,比活为2646 U/mg。

Bacillus sublitis JH-1木聚糖酶的纯化及酶学性质

对枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1胞外木聚糖酶的纯化及酶学性质进行了研究。通过（NH4）2SO4分级沉淀法、透析除盐、DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析等方法,从枯草芽孢杆菌Bacillus sublitis JH-1发酵液中分离纯化得到了电泳纯的木聚糖酶,其相对分子质量为3.45×10^4,比活力为75 899.68 U/mg。酶学性质研究结果表明：该酶的最适p H为6.0,在最适p H条件下保温2 h后仍能保持75%的活力,而p H越高,活力下降越快,表明为酸性木聚糖酶;最适温度为55℃,在50-60℃保温2 h后仍具有70%左右相对较高的活性,说明该酶具有较强的耐高温性;Fe^2＋、Mg^2＋、Ca^2＋、Zn^2＋、Ba^2＋和低浓度（5 mmol/L）的Fe^3＋对酶的活性有促进作用,而Mn2＋和高浓度（10mmol/L）的Fe^3＋对酶的活性有抑制作用。

地衣芽孢杆菌弹性蛋白酶纯化和性质研究

用地衣芽孢杆菌发酵液制备弹性蛋白酶粗酶液,采用硫酸铵分级沉淀和Sephadex凝胶柱层析的方法分离纯化弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的酶学性质进行研究。结果表明:弹性蛋白酶粗酶液经40%～70%饱和度的硫酸铵纯化后比活力提高到120U/mg,经凝胶柱层析纯化后比活力可达到292U/mg,纯化倍数为12.6,SDS-PAGE法证实弹性蛋白酶分子质量为29.5kD。对酶学性质的研究结果表明:弹性蛋白酶最适反应温度为55℃,最适反应pH值为7.4,以刚果红-弹性蛋白为底物,米氏常数Km为9.67mg/mL。低浓度金属离子Ca2+和K+对酶活力有促进作用,而Mg2+、Mn2+、Zn2+和Al3+对酶活力则有抑制作用。

枯草芽孢杆菌A30菌株产生的拮抗肽的分离纯化与理化性质研究

平皿测试表明 Bacillussubtilis A30菌株对多种植物病原真菌 ,例如水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea)等有强烈抑制作用。在小区试验中 A30菌液对水稻纹枯病也表现出了较好的防治效果。 A30菌株培养液经硫酸铵沉淀、FPL C疏水色谱、HPLC反相色谱后 ,纯化得到一种拮抗活性物质 ,命名为 P1。 P1对热稳定 ,对蛋白酶不敏感 ;茚三酮反应呈阴性 ,用酸水解后茚三酮反应和双缩脲反应呈阳性。经 L C- ESI- MS分析初步判断 P1的分子量为14 76 .

枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

枯草芽孢杆菌ZC-7的发酵液,经离心分离得到粗酶液,再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、SephadexG-75柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋白酶。SDS-PAGE测得其分子量大约为42kDa。以酪蛋白为底物时,该酶的Km为5×10-3,Vmax为2.5×104μg/min,酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为55℃,在pH6.5～8.0,40℃以下较稳定,对1mol/Lh2O2具有一定的耐受性。EDTA、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用,Ca2+、Mg2+和Li+离子对其具有保护作用。

枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化及酶学性质研究

对枯草芽孢杆菌BEM01菌株发酵液中的弹性蛋白酶进行了分离纯化,并研究了酶学性质。先后采用了硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和分子筛层析等方法,弹性蛋白酶的回收率为7.88%,纯化倍数为13.79,结合SDS-PAGE和分子筛层析确定该弹性蛋白酶是一单链蛋白,分子量约为31ku。对酶学性质的研究表明,该弹性蛋白酶属于含有Ca2+的金属蛋白酶类;其最适作用温度为50℃,具有良好的热稳定性;在硼砂-硼酸缓冲体系、Tris-HCl缓冲体系中酶最适反应pH分别为7.4和8.6,在pH8.0～11.0酶活力趋于稳定;10mmol/L的Ca2+有激活和稳定酶活作用,SDS和吐温-80也有激活酶活作用,而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和EDTA对酶活均有不同程度的抑制作用;其催化动力学方程为:y=0.186x+32.493;V=0.0308U/mL,K=0.0057g/mL。

枯草芽孢杆菌产酶规律及酶学性质研究

[目的]研究浙江建德分离得到的枯草芽孢杆菌淀粉酶的产酶规律和酶学性质。[方法]将分离得到的枯草芽孢杆菌发酵培养,研究其淀粉酶产酶规律,并研究了温度、pH、金属离子对酶学性质的影响。利用双倒数曲线法获得该酶的米氏常数Km。[结果]随着发酵时间的延长,发酵液中淀粉酶的含量提高。在培养30h时,产酶量达到最高。该淀粉酶的最佳反应温度和pH分别为40℃和7.5。该酶具有一定的热稳定性,对酸碱条件较敏感。Na+、K+、Ca2+、Mg2+对该酶具有激活作用,Pb2+、Hg2+对该酶具有显著的抑制作用,Cu2+的影响不显著。该淀粉酶的米氏常数Km为2.31×10-3mol/L。[结论]该研究对该菌株淀粉酶的开发及工业应用具有较强的指导意义。

2个枯草芽孢杆菌源纤维素酶基因的克隆、融合表达及其酶学性质分析

本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性,除Mn^(2+)外的其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg^(2+)和Cu^(2+)对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。

一株烟草秸秆降解菌的分离、鉴定及酶学性质研究

从皖南地区烟稻轮作田土壤中经CMC-Na初筛获得5株纤维素降解菌,经DNS法测定纤维素酶活性复筛得到一株降解活性较高的降解菌YC-2。根据该菌16S r DNA序列比对结果,结合形态和生理生化特征,确定YC-2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对YC-2酶学性质进行相关研究,并分析YC-2对烟碱的耐受情况及对烟草秸秆的降解情况,结果表明：在7天内,YC-2对烟草秸秆降解率为10.14%;酶学特性表现为最适反应温度为60℃且在15-60℃之间具有稳定性;最适反应pH为7.0,在pH 4.0-7.5范围内稳定性较好;YC-2在浓度为1-2 g/L烟碱中能快速生长,而在高浓度的烟碱中生长受到抑制。因此,菌株YC-2产纤维素酶活性较高、相对耐热耐碱且对烟杆有一定分解作用,通过进一步诱变选育和发酵条件优化有较好的田间应用潜力。

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶的纯化及酶学性质

枯草芽孢杆菌C-36纤维素酶经硫酸铵、SephadexG-75、SephadexG-100分离纯化后,得到一个电泳纯的葡聚糖内切酶。SDS-PAGE结果表明,该酶分子量约为35kD。最适反应温度和pH分别为65℃和pH6.8,Zn2+、Pb2+、Fe3+对酶有抑制作用,Ba2+、Fe2+对酶有激活作用,在50℃,pH6.8条件下,酶对CMC-Na的米氏常数Km为0.34g/L,最大反应速度Vmax为0.17mg/(min.mL)。

侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB600中,转化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG(1.0 mmol.L-1)的诱导下,发酵液上清中的蛋白酶活可达到620 U.mL-1,高于出发菌株G4的BLG4酶活(240 U.mL-1).经SDS-PAGE分析,重组子pWT22-BLG4/WB600产生了一条分子质量约为30 ku的条带,该条带的大小与侧孢短芽孢杆菌G4上清发酵液中BLG4条带的大小一致.而未经IPTG诱导的重组子pWT22-BLG4和经IPTG诱导的WB600则未出现该条带.结果证明侧孢短芽孢杆菌G4的碱性蛋白酶基因BLG4已在枯草芽孢杆菌WB600中获得了成功表达.重组蛋白酶具有与侧孢短芽孢杆菌G4产生的BLG4蛋白酶同样的酶学性质.同时,重组蛋白酶具有明显的杀线虫和体壁降解能力,表明其在线虫生物防治中将有广泛的应用前景.

重组弹性蛋白酶诱导表达、纯化及酶学特性研究

将已构建好的表达载体pPIC3.5K/PAE转化毕赤酵母KM71,经甲醇诱导表达弹性蛋白酶,通过对发酵条件的初步优化,确定毕赤酵母重组菌株表达的最佳条件为:甲醇浓度1%,最佳诱导时间4d。通过DEAE-SepharoseFF弱阴离子交换柱一步纯化,获得良好的纯化效果。该重组蛋白酶最适pH值范围6.0～8.5,最适温度范围为25～40℃,催化反应条件温和。Ca2+和Mg2+对重组弹性蛋白酶活性有不同程度的促进作用,Zn2+、Cd2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+和EDTA对该酶有不同程度的抑制作用。

易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性

近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明：F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变：D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。

海洋高产尿酸氧化酶菌株筛选鉴定及酶学性质研究

尿酸氧化酶广泛用于常规临床分析和临床药物,在医学治疗和诊断中的重要性日益增加。为得到高产尿酸氧化酶的优良菌株,以大连黄海海泥、海水为材料,依次分别采用透明圈法、酶偶联分光光度法进行初筛和复筛,获一株高产尿酸氧化酶菌株Z7,根据菌株Z7的16S rDNA基因序列和形态学、生理生化特征,该菌株被鉴定为苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)。酶学性质研究表明:尿酸氧化酶蛋白的分子量约为33.1 kD;最适作用温度是25℃,酶活高达673.7 U/mg;最适作用pH为8.0,在pH 8-9表现出较强的稳定性;Fe^3+、Ca^2+对尿酸氧化酶具有激活作用。Ag^+、Hg^2+对该酶抑制性较强,使其几乎丧失活性。该菌株产酶活性及稳定性良好,可为尿酸氧化酶的工业化生产奠定理论基础,并具有潜在开发价值。

海洋葡甘聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究

以海泥和海水为样品,采用稀释涂布平板法初筛、摇瓶发酵复筛,得到一株葡甘聚糖酶高产菌Q1,测得酶活为187.68 U/m L。通过形态学、生理生化特征及16S rDNA序列分析,鉴定菌株Q1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其所产酶最适作用温度为35℃,热稳定性较差;最适作用pH值为6.0,碱性条件下,pH稳定性较差;Cu^(2+)、Fe^(2+)、乙二胺四乙酸(EDTA)对该酶抑制性较强,Mg^(2+)对该酶抑制性较弱,NH_4^+对该酶的活性影响不明显,Na^+对该酶激活作用较弱,Mn^(2+)对该酶激活作用较强。该酶只在外源诱导物存在时,才能大量合成,说明该酶是诱导酶。

枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的纯化及其酶学性质

利用硫酸铵盐析缓冲液透析、聚乙二醇浓缩、DEAE-Sepharose FF窝子交换层析等方法，纯化了枯草芽孢杆菌WD-23β-甘露聚糖酶，并研究了其酶学性质。结果表明：纯化的枯草芽孢杆菌WD-23β-甘露聚糖酶的分子质量约为40 ku，酶的纯化倍数为14.1倍；最适反应pH和pH稳定范围分别为5．6和5．0～7．0；最适反应温度和温度稳定范围分别为55℃和40～70℃；Ca2＋对该酶的促进作用最为明显，Li＋的抑制作用最明显。