绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其毛壳菌转化

利用PCR方法从Trichoderma viride的基因组DNA中克隆了一个42kDa的内切几丁质酶基因,扩增的长度为1672bp,其中包含了启动子和mRNA的编码区。将该基因与来自构巢曲霉的色氨酸启动子相连后,通过原生质体转化将该基因导入球壳毛壳菌CG10。内切几丁质酶活性的测定结果表明,约1/3转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高。本实验为利用基因工程方法提高毛壳菌的生防能力打下了较好的基础。

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用 PEG方法 ,将含有潮霉素抗性标记的质粒 p CB10 0 3转化毛壳霉原生质体 ,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达 1～ 2个转化子 / μg质粒 DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组 DNA为模板进行 PCR扩增及其产物的 Southern杂交。结果表明 ,潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明 。

多菌灵抗性基因在球毛壳中的转化

利用PEG方法将多菌灵抗性基因通过质粒 pRB12 9转化到球毛壳原生质体 ,并在含 0 .5 μg/ml多菌灵浓度下筛选转化子 ,转化率可达 6～ 7个转化子 / μgDNA。转化子可在 10 0 0 μg/ml多菌灵处理条件下正常生长。将转化子在非选择压力下连续培养 10代 。

球毛壳菌荧光标记与重寄生现象研究

球毛壳菌是一种非常重要的生防真菌.为了从分子生物学水平研究球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机制,选用GFP(green fluorescent protein)作为报告基因对球毛壳菌进行标记.通过构建和转化EGFP(Enhanced GFP)表达载体,得到氯嘧磺隆抗性的转化子.经过几轮验证筛选,包括选择性平板筛选、PCR扩增目的片段验证、Southern杂交、荧光镜检等,确认SUR基因和EGFP基因已经插入球毛壳菌的基因组并在其中表达标记.取一个确认为荧光标记转化子的菌株,进行生防特性分析.主要通过与病原真菌平板共培养、载玻片对峙培养等方法初步研究了球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机理.结果发现,在对立枯丝核菌的抑制过程中,球毛壳菌的拮抗机理主要是重寄生作用.

根癌农杆菌介导的球毛壳菌遗传转化及T-DNA插入突变体的获得

根癌农杆菌介导的遗传转化系统是植物基因工程常用方法 ,目前已将这一转化系统应用到酵母、丝状真菌以及人类细胞的转化。利用这一转化系统 ,成功地实现了丝状真菌球毛壳菌 (Chaetomiumglobosum)的遗传转化 ,转化率约为 6 0～ 180个转化子 10 7个孢子。通过对转化子的PCR检测和Southern杂交分析表明 ,T DNA已整合进毛壳菌基因组中 ,而且在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合 ,转化子都能够稳定遗传。根癌农杆菌介导的遗传转化具有转化率高、低拷贝、遗传稳定、操作简便等优点 。

影响球毛壳菌原生质体转化的因素

采用PEG介导的原生质体转化法研究了含有多菌灵抗性基因的质粒pRB129转化球毛壳菌的影响因素。结果表明,最佳转化条件为:以1.0mol/L山梨醇作为渗透压稳定剂,20mol/L Ca^(2+)和终质量分数为50％的PEG4000作为转化介质,于25℃转化10min,采用缓慢逐步稀释的方法,转化后1.5d筛选转化子,此时,转化率最高,且有较高的重复性,DNA平均转化率为5.6个/μg。该结果对球毛壳菌其他性状的改进及其他丝状真菌的遗传转化具有重要参考价值。

根癌农杆菌介导的CryⅠA(b)基因在毛壳菌中的转化

利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法,将CryⅠA(b)基因转入生物防治真菌毛壳菌中,转化率约为40～180个转化子·10-7个孢子。通过对转化子的RT-PCR检测和Southern杂交分析表明,CryⅠA(b)基因已整合进毛壳菌基因组中,而且在转录水平上得到表达,转化子都能够稳定遗传。根癌农杆菌介导的遗传转化具有高转化率、低拷贝、遗传稳定、操作简便等优点,因此有可能成为丝状真菌遗传转化和功能基因组研究的有力工具。

转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用

含有来自绿色木霉Trichoderma viride的内切几丁质酶基因chbi的真菌表达载体pECHBI,通过原生质体转化将该基因导入球毛壳菌Chaetomium globosumCG12菌株,内切几丁质酶活性的测定结果表明,1/5的CG12转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高,PDA平板测定证实毛壳菌转化子对9种病原真菌具有拮抗能力,其中4株转化子的拮抗能力被显著提高.

纤维素降解球毛壳菌NK-102的高效遗传转化方法

【目的】在球毛壳菌(Chaetomium globosum)NK-102中,建立菌株特异性转化体系。【方法】构建新的抗性标记pUCATPH-Pgap,转化效率优于pUCATPH和pCM768。建立了PEG-原生质体和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导的两种转化方法。【结果】原生质体转化效率为30-50个转化子/10μg DNA,抗性标记pUCATPH-Pgap效率最高。EHA105介导转化率达到3.2×102转化子/107孢子。Southern blot证明DNA随机整合于基因组中,转化子抗性稳定。【结论】两种转化体系的建立为筛选高效利用纤维素的球毛壳菌突变株奠定了基础。