低氧诱导因子过表达对人外周血内皮祖细胞分化影响的体外研究

为了研究低氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor-1alpha,HIF-1α)在体外对人外周血内皮祖细胞(endothe-lialprogenitorcells,EPC)向血管内皮细胞(endothelialcells,EC)分化的影响,用密度梯度离心法分离人外周血EPC,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPC,计算转染效率,RT-PCR方法测定HIF-1α、HIF-1β及HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA在质粒转染前后含量变化,免疫细胞化学方法检测在常氧下HIF-1α蛋白在HIF-1α质粒转染前后不同时点蛋白表达情况,细胞膜表面抗原决定簇流式细胞术测定FITC-CD31+EPCs/EC在未转染组、pEGFP空质粒或HIF-1α质粒转染组转染3-10天后的组间差异,光镜下观察转染前后细胞形态及分化程度。结果表明:EPC获得后经电穿孔转染,质粒转染效率约20%;RT-PCR示HIF-1αmRNA在常氧中有表达,并在HIF-1α过表达组含量增加(P<0.05);其下游靶基因VEGF在HIF-1α过表达组表达上调(P<0.05);HIF-1β表达在各组中无明显差异(P>0.05)。免疫组织化学显示常氧下HIF-1α蛋白无表达,转染HIF-1α质粒12小时后HIF-1α蛋白表达阳性,转染24小时后蛋白表达阴性。流式细胞仪检测显示电穿孔转染HIF-1α质粒使CD31+细胞的百分比增加(P<0.05)。细胞形态学观察显示:未转染及pEGFP空质粒转染组细胞在培养6天后呈集落样散在分布,培养14天后贴壁细胞部分呈梭样;穿孔转染的HIF-1α质粒组细胞于培养6天后集落周边分化出梭样贴壁细胞,培养14天后呈梭样,或铺路石样牢固贴壁。结论:HIF-1α质粒能有效地用于基因干扰治疗,有助于EPC向EC分化,为体内研究奠定了基础,也为进一步体内诱导血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择。

siRNA干扰HIF-1α抑制人外周血内皮祖细胞分化

背景与目的:低氧诱导因子鄄1α(hypoxiainduciblefactor鄄1alpha,HIF鄄1α)在促血管新生中起关键作用,通过基因沉默方法研究促肿瘤发展因子对细胞分化的影响可为体内抗癌治疗提供指导。本研究构建了HIF鄄1α的RNA干扰(RNAi)质粒,在体外研究其对人外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)向血管内皮细胞(endothelialcell,EC)分化的影响。方法:质粒重组技术构建siRNA鄄HIF鄄1α质粒,电穿孔转染质粒,计算转染效率;RT鄄PCR法检测HIF鄄1α、HIF鄄1β及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA在质粒转染前后含量变化;免疫组化方法检测在常氧/低氧下和siRNA鄄HIF鄄1α质粒转染后12hHIF鄄1α蛋白表达情况;流式细胞术测定FITC鄄CD31+的EPCs/EC在各组细胞转染3～10天后的组间差异;一氧化氮酶法鉴定各组细胞VEGF依赖性一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)含量;镜下观察转染前后细胞形态及分化程度。结果:重组子质粒测序鉴定证实siRNA鄄HIF鄄1α构建与设计相符,电转效率约20%;转染6h各组HIF鄄1αmRNA在常氧中及低氧中均表达,并可被siRNA鄄HIF鄄1α不同程度抑制(P<0.05),相应的下游靶基因VEGF表达下调(P<0.05),HIF鄄1β表达在各组中无显著性差异(P>0.05)。免疫组化示常氧及低氧1hHIF鄄1α蛋白无表达,低氧3h成倍出现,6h达高峰,24h降至基线水平;siRNA鄄HIF1α抑制后低氧12h,HIF鄄1α蛋白表达被显著抑制。流式细胞仪检测发现,经siRNA鄄HIF鄄1α抑制后CD31+细胞较对照组在常氧及低氧中表达下调(P<0.05)。siRNA减少eNOS含量,并与培养时间及VEGF刺激浓度呈反比(P<0.01)。细胞形态学观察示低氧可诱导并加速EPCs向EC定向分化、扩增,但可被siRNA鄄HIF鄄1α抑制。结论:固有的或低氧诱导的HIF鄄1α表达足以影响下游靶基因表达,siRNA能抑制促血管新生的靶基因,抑制EPCs向EC分化。

低氧诱导因子在低氧中对人外周血内皮祖细胞分化的影响

目的研究低氧诱导因子1α在体外氧化压降低环境中对人外周血内皮祖细胞向血管内皮细胞分化的影响。方法密度梯度离心法分离人外周血内皮祖细胞,电穿孔技术转染低氧诱导因子1α质粒,计算转染效率;逆转录聚合酶链反应测定常氧和低氧环境中低氧诱导因子1α、1β及其血管内皮生长因子mRNA在质粒转染前后表达变化。Westernblot检测转染前后低氧诱导因子1α蛋白表达,流式细胞术测定细胞膜表面抗原决定簇、荧光报告蛋白空质粒或低氧诱导因子1α质粒转染组转后的组间差异,一氧化氮酶法鉴定各组血管内皮生长因子依赖性一氧化氮的释放活性,镜下观察细胞形态及分化程度。结果质粒转染效率约20%;转染20h,低氧诱导因子1αmRNA在常氧中及低氧中均有表达,表达程度与氧浓度无关(P>0.05);低氧及转染低氧诱导因子1α基因诱导血管内皮生长因子表达上调(P<0.05);1β亚基表达在各组中无明显差异(P>0.05)。1%低氧3h低氧诱导因子1α蛋白开始表达,6h时表达成倍增加,12h达高峰,24h表达回到基线水平。流式细胞仪检测发现,转染后常氧下孵育3天,转pEGFP组CD31+细胞占总细胞数40.2%±4.3%,低氧诱导因子1α组占53.8%±3.7%(P<0.05);孵育10天后转pEGFP组CD31+细胞占51.8%±3.5%,低氧诱导因子1α组占66.2%±6.6%(P<0.05)。转染后低氧下孵育3天,转pEGFP组CD31+细胞占总细胞数46.8%±3.5%,低氧诱导因子1α组占60.2%±5.0%(P<0.05);孵育10天,转pEGFP组CD31+细胞占59.0%±3.5%,低氧诱导因子1α组占76.1%±1.9%(P<0.05)。低氧较常氧易促一氧化氮释放,转染低氧诱导因子1α基因使一氧化氮释放增加,释放含量与血管内皮生长因子刺激量成正比,随刺激时间延长而增加(P<0.01)。低氧环境加快内皮祖细胞向内皮细胞分化、扩增,低氧诱导因子1α质粒转染同样促进内皮祖细胞分化。结论低氧诱导因子1α质粒能有效地应用于转录水平进行基因干扰治疗,并在低氧环境中增效,有助于促进内皮祖细胞向内皮细胞分化,为进一步诱导体内血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择。

重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α对血管新生的影响

目的研究重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402-Ala803,简称Ad-HIF-1α-564/402/803)对体外血管新生的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,终点稀释法测定病毒滴度,提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定三突变型HIF-1α基因;X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null分别转染hMVECs后,观察hMVECs在Matrigel上毛细血管管腔样结构的形成情况;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null和PBS分别转染鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型后,利用Image Pro Plus6.0软件收集数据并计算各组CAM血管面积比。结果经PCR及基因测序鉴定,扩增纯化后的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异,病毒滴度达1011～1012PFU/ml;X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定;Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs后Matrigel上的管腔数目显著多于Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null及对照组;基因转染CAM72h后,Ad-HIF-1α-564/402/803组CAM上微小血管数目较Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组明显增多;Ad-HIF-1α-564/402/803组血管面积比与Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组相比,差异有统计学意义(P值分别为0.01、0.000、0.000)。结论Ad-HIF-1α-564/402/803能明显促进hMVECs毛细血管管腔样结构的形成,同时可以促进CAM模型上微小血管新生,证实了Ad-HIF-1α-564/402/803在常氧情况下对血管新生有一定的促进作用。

HIF-1α/SDF-1信号轴在低氧诱导祖细胞迁移和黏附中的作用

目的:分析低氧对大鼠肺动脉内皮细胞低氧诱导因子(HIF-1α)及间质细胞衍生因子(SDF-1)表达的影响,探讨二者的相互关系(即是否存在HIF-1α/SDF-1信号轴)及其在低氧诱导祖细胞迁移和黏附中的作用。方法:免疫磁珠分离纯化SD大鼠外周血CD34/CXCR4阳性祖细胞,免疫荧光、Western blotting及ELISA法检测不同低氧时间HIF-1α和SDF-1在大鼠肺动脉内皮细胞的表达,迁移和黏附实验检测常氧组、低氧组、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2)组、SDF-1中和抗体组及同时加2ME2和SDF-1中和抗体组祖细胞的迁移指数和黏附率。结果:HIF-1α和SDF-1的表达与低氧时间有关,低氧12h时二者表达到峰值(均P<0.01),应用2ME2可使SDF-1表达下调(P<0.05),应用2ME2或SDF-1中和抗体后均下调祖细胞的迁移指数和黏附率(P<0.05)。结论:低氧可诱导肺动脉内皮细胞HIF-1α及受其调控的下游因子SDF-1的表达,提示HIF-1α与SDF-1存在信号调节关系。HIF-1α/SDF-1信号轴在介导祖细胞迁移和黏附至肺动脉内皮细胞的过程中起重要作用。

蜂毒素对荷骨肉瘤裸鼠体瘤内皮祖细胞数量和细胞因子HIF-1α及SDF-1α的影响

目的观察蜂毒素对荷骨肉瘤裸鼠微血管生成的影响,并探讨其作用的机制。方法建立荷骨肉瘤裸鼠模型,随机分为生理盐水组和蜂毒素低、中、高剂量组,分别予以生理盐水及蜂毒素160、320、640μg/kg的剂量局部干预瘤体。采用免疫荧光染色法、免疫组织化学染色法和显微图像分析技术检测各组荷骨肉瘤裸鼠肿瘤中内皮祖细胞(EPC)数量及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的表达。结果与生理盐水组比较,蜂毒素低、中、高剂量组肿瘤组织中CD34/CD133双阳性细胞的数量均明显减少,HIF-1α、SDF-1α的阳性表达率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论蜂毒素能减少荷骨肉瘤裸鼠肿瘤组织中EPC数量,其作用机制可能与蜂毒素下调HIF-1α和SDF-1α蛋白表达有关。

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型。将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,Western-blotting分析VEGF蛋白的表达,并用流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。结果转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98±0.55)%,而转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38±0.48)%(P<0.01),转染pAdCMVVEGF165+VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07±0.64)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论腺病毒介导的VEGF165基因能高效表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。

重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α转染大鼠内皮祖细胞

目的:研究含缺氧诱导因子(HIF-1α)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒(Ad-EGFP/HIF-1α)感染大鼠内皮祖细胞(EPCs)的可行性.方法:采用percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,VEGF,bFGF,EGF诱导培养,观察其形态学变化,免疫细胞化学染色鉴定其表面抗原.Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后转染体外培养的EPCs,分别于24,48,72,96h采用倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)情况.MTT检测细胞生长活性;流式细胞术检测转染率并用RT-PCR法测定HIF-1α在EPCs中的表达.结果:倒置荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,随着时间的延长,绿色荧光逐渐增多.MTT法检测细胞在24,48,72,96h的存活率分别为99.83%,99.70%,99.32%,99.57%;流式细胞仪计数随时间的延长,转染率逐渐升高,24,48,72,96h的转染率分别为23.05%,45.94%,78.91%,85.64%.RT-PCR可检测到被感染细胞HIF-1α的表达.结论:重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α能够有效地感染EPCs,转染后在mRNA水平可检测到EPCs中有HIF-1α的表达,并对EPCs活性无明显影响,为进一步研究转基因的EPCs移植促血管新生奠定基础.

三突变型低氧诱导因子-1α对人微血管内皮细胞增殖及VEGF蛋白表达的影响

目的观察重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人微血管内皮细胞(hMVECs)增殖及VEGF蛋白表达的影响。方法三突变型HIF-1α腺病毒载体(Ad-HIF-1α564/402/803)、野生型HIF-1α腺病毒载体(Ad-HIF-1αnature)、Ad-LacZ及空载腺病毒载体(Ad-Null)分别在HEK293A细胞大量扩增,氯化铯梯度离心纯化,终点稀释法测定病毒滴度;双荧光素酶报告系统检测三突变型HIF-1α与野生型HIF-1α的转录活性;各重组腺病毒载体以最佳转染复数转染体外培养的hMVECs,Western blotting测定HIF-1α和VEGF蛋白表达;MTS检测Ad-HIF-1α564/402/803对细胞增殖的影响。结果三突变型HIF-1α转录活性显著高于野生型HIF-1α(P<0.001);Ad-HIF-1α564/402/803组HIF-1α和VEGF蛋白表达量高于Ad-HIF-1αnature及其他组;VEGF蛋白表达水平与HIF-1α呈剂量依赖关系。Ad-HIF-1α564/402/803组第3、5天吸光度值均显著高于Ad-HIF-1αnature及其他组(P<0.01)。结论三突变型HIF-1α在体外常氧条件下稳定高效表达,可诱导hMVECs VEGF蛋白表达上调,促进hMVECs增殖。

低氧诱导因子-1α小干扰质粒(siHIF-1α)抑制体内血管新生

本研究拟通过腺病毒感染法观察低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的干扰质粒在体内对新生血管的抑制作用。构建干扰性si RNA质粒(si HIF-1α),在体外通过腺病毒介导的方法将人si HIF-1α质粒(Ad-si HIF-1α)转入人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC);观察EPC的感染效率;确定病毒滴度;并将此Ad-si HIF-1αEPC移植至缺血下肢模型,观察对新生血管的抑制作用。结果显示Ad-si HIF-1α感染效率约80%,移植异种Ad-si HIF-1α-EPC至Balb/c鼠缺血下肢后发现干扰后的EPC在体内显著抑制缺血部位的HIF-1αmRNA及蛋白(P<0.05);Ad-si HIF-1α-EPC较对照组进一步抑制体内毛细血管数目(P<0.05);干扰组血流减慢,皮温降低(P<0.05),缺血局部细胞扩增减少(P<0.05)。表明Ad-si HIF-1α干扰后的EPC在体内可抑制缺血下肢的局部血管新生。

人低氧诱导因子1-α转染人骨髓内皮祖细胞的体外实验

目的:将人低氧诱导因子1-α(HIF1-α)转染人骨髓内皮祖细胞(EPCs),为探讨转染HIF1-α基因的EPCs对梗塞心肌血管修复及血管再生能力提供依据。方法:密度梯度法分离人骨髓中单个核细胞,以1×106.mL-1细胞浓度接种于用纤维连接蛋白包被的培养皿中,培养14d后采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性成分ecNOS、flk-1的表达;采用acLDL-Dil和FITC-UEA-1对细胞染色;采用LipofectamineTM 2000介导PCDNA3.0-HIF1-α质粒转染EPCs,RT-PCR检测HIF1-α的转录;ELISA检测细胞上清中VEGF表达;免疫印迹法检测HIF1-α蛋白表达。结果:培养第5天起,部分圆形单核细胞转化为梭形贴壁EPCs,7d左右出现由数十个细胞形成的细胞集落,10d后形成明显克隆。RT-PCR检测ecNOS在548bp处出现条带,flk-1在819bp处出现条带;acLDL-Dil和FITC-UEA-1双染色阳性;RT-PCR在383bp处出现特异性条带;ELISA转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为(20.53±2.33)μg·L-1,未转染HIF1-α的EPCs上清中VEGF含量为(3.96±1.67)μg·L-1,两组比较差异有显著性(P<0.05)。免疫印迹法(Western blotting)检测在相对分子质量120000处出现条带。结论:PCDNA3.0-HIF1-α质粒成功转染EPCs。

低氧诱导因子修饰内皮祖细胞促血管新生的研究

目的观察低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)转染内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)后,EPCs在体外的扩增及迁移功能改变及对体内缺血下肢血管新生的影响。方法在人外周血EPCs中导入人HIF-1α基因。结果转染后的EPCs中HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA及蛋白表达升高,并被特异性siRNA-HIF-1α中度抑制;功能学检测示HIF-1α过表达增加了EPC在体外的分化、扩增、迁移;内皮细胞(EC)标记物CD31、VEGFR2、eNOS及VEGF、NO分泌增加;移植HIF-1α-EPCs至缺血下肢后可见外源性EPCs存在于缺血部位;HIF-1α-EPCs较对照组进一步促进体内毛细血管数目增加。结论在体外,HIF-1α转染后的EPCs扩增及迁移功能改善;在体内,可促进缺血下肢的局部血管新生。

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α(H IF-1α)促血管内皮祖细胞(EPCs)成血管活性的可行性。方法密度梯度法分离人外周血EPCs,电穿孔技术转染H IF-1α质粒至EPCs,RT-PCR法观察未转染/转染质粒在转染后3、12、20、72 h,H IF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的变化;免疫组化法检测常氧中转染前后H IF-1α蛋白表达、VEGF受体F lk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶(eNOS)含量的改变。结果H IF-1α基因有效转染入EPCs;H IF-1αmRNA在未转染时即有表达,在H IF-1α质粒转染后3、12、20、72 h,含量较未转染时增加(P<0.05);H IF-1α过表达诱导VEGF表达上调(P<0.05)。F lk-1蛋白在常氧下有一定含量,在H IF-1α质粒转染后F lk-1蛋白表达进一步增加。VEGF释放含量在H IF-1α过表达组显著增加(P<0.05);H IF-1α诱导eNOS含量增加,并与时间、VEGF刺激量成正比。结论H IF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs,促进其下游靶基因及受体表达,引起相应的功能学改变,促EPCs向内皮细胞分化、扩增,可进一步应用于基因治疗。

重组人血管内皮抑制素在晚期非小细胞肺癌化疗患者中的应用效果

目的探讨重组人血管内皮抑制素在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)化疗患者中的应用效果。方法依据随机数字表法将120例晚期NSCLC患者分为观察组和对照组,每组60例。对照组患者予以顺铂注射液治疗,观察组患者在对照组的基础上联合重组人血管内皮抑制素注射液治疗。比较治疗前后两组患者的肿瘤标志物[细胞角质蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原50(CA50)]水平、肺功能指标[用力肺活量占预计值百分比(FVC%)、第一秒用力呼气量(FEV1)以及最大通气量(MVV)]、外周血血管内皮生长因子(VEGF)和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)水平、生活质量及免疫功能指标(CD3^(^(+))、CD4^(+)、CD8^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+))。结果治疗后,观察组患者的CYFRA21-1、CEA、CA50水平均低于对照组,FVC%、FEV1、MVV均高于对照组,外周血VEGF和HIF-1α水平均低于对照组,功能情况、情感情况、社会/家庭情况、生理状态评分均低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。观察组患者的不良反应总发生率为5.00%,低于对照组的16.67%,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论重组人血管内皮抑制素有利于降低晚期NSCLC化疗患者的肿瘤标志物及外周血VEGF和HIF-1α水平,改善肺功能,提高生活质量,增强免疫功能,降低不良反应发生率。

可溶性环氧化物水解酶抑制剂对小鼠内皮祖细胞分泌血管内皮生长因子及缺氧诱导因子-1α的促进作用

目的探讨可溶性环氧化物水解酶抑制剂(t-AUCB)能否促进小鼠来源内皮祖细胞(EPCs)分泌内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),及可能的相关机制。方法提取小鼠长骨骨髓,离心分离培养,取得高纯度EPCs,不同浓度可溶性环氧化物水解酶抑制剂(t-AUCB)和过氧化体增殖物激活型受体γ(PPAR-γ)阻断剂GW9662单独或联合干预EPCs,Western blot检测上述EPCs体外分泌VEGF及HIF-1α情况。结果从0~100μmol/L,t-AUCB呈浓度依赖性增强EPCs体外分泌VEGF、HIF-1α能力,而5μmol/L t-AUCB阻断剂GW9662可抑制EPC上述功能。1、10、50、100μmol/L t-AUCB促进EPCs分泌VEGF、HIF-1α能力与0μmol/L t-AUCB相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);GW9662+100μmol/L t-AUCB与100μmol/L t-AUCB比较,差异具有统计学意义(P<0.05),与0μmol/L tAUCB比较,差异也具有统计学意义(P<0.05)。结论t-AUCB可促进EPCs分泌VEGF及HIF-1α,其机制可能与激活PPAR-γ通路有关。

低氧诱导因子-1α基因体外转染内皮祖细胞的可行性及对其成内皮细胞活性的影响

目的探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因体外转染入内皮祖细胞(EPCs)的可行性及对其表现型的影响。方法构建真核表达载体pEGFP-HIF-1α。分离外周血单个核细胞(PBMC)及脐血CD34+单个核细胞(MNCCD34+)。采用电穿孔基因转染,荧光显微镜检测转染效率,逆转录聚合酶链反应检测HIF-1α的表达。培养1周后,分为4组:A组:只加入血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导培养;B组:转染入空质粒pEGFP-C1,并加入VEGF、bFGF;C组:转染入pEGFP-HIF-1α质粒;D组:未加VEGF、bFGF诱导。采用流式细胞仪检测CD31阳性细胞百分率。结果构建的pEGFP-HIF质粒基因序列与基因库(U22431, gi:881345)HIF-1α的CDS编码区完全一致。PBMC转染效率达38％,MNC CD34+转染效率达到42％。PBMC培养1周时,A、B、C组间CD31阳性率的差异无显著性(P值均>0．05),但均显著高于D组(P值均<0．05)。MNCC CD34+培养1周后,A、B、C组间CD31阳性率的差异无显著性(P值均>0．05)。结论真核表达载体pEGFP-HIF体外电穿孔转染入PBMC,提示转染HIF-1α能促祖细胞向内皮细胞分化,效果与加入细胞因子诱导相似,其能增加祖细胞增殖活性。

低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86)ng/mL。结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFPHIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。

缺氧诱导因子-1α与绿色荧光蛋白在神经干细胞中的共表达

目的:以携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒转染大鼠神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs),观察HIF-1α和GFP在NSCs中的表达以及对NSCs生物学特性的影响,为HIF-1α基因转染的NSCs移植治疗缺血性脑血管病提供物质基础。方法:利用携带HIF-1α和GFP基因的重组腺病毒转染NSCs,相差显微镜下观察NSCs的形态及在荧光显微镜下观察NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;观察HIF-1α基因在NSCs中的表达;并检测NSCs的细胞活性。应用免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白(Nestin)、神经微丝蛋白(Neurofilamentprotein)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结果:重组腺病毒转染NSCs后外源性基因及绿色荧光蛋白有持续稳定表达;转染后的NSCs的形态学、细胞活性和分化能力等与未转染的NSCs无明显差异(P>0.05);检测神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实转染后的NSCs仍然具有多向分化潜能。结论:NSCs转染携带HIF-1α和GFP基因的重组腺病毒后能够持续、稳定地表达HIF-1α和GFP,生物学特征正常。

阻塞性睡眠呼吸暂停患者外周血内皮祖细胞及促血管生成因子水平研究

目的观察阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)患者外周血内皮祖细胞(EPC)不同亚族和促血管生成因子水平的变化,探讨不同程度OSA患者外周血EPC对血管修复的可能性。方法选取90例OSA患者和30例健康志愿者(对照组),根据睡眠呼吸暂停低通气指数(AHI)将90例OSA患者均分为轻、中、重度OSA组。密度梯度离心法提取单个核细胞,依据乙醛脱氢酶(ALDH)活性对EPC进行分选,流式细胞仪联合CD133、CD34、含激酶域插入片段受体(PE-KDR)相应细胞表面标志物测定CD133~^+KDR^+EPC及CD133^+CD34^+EPC、CD34^+KDR^+EPC、ALDHloCD34^+KDR^+EPC的水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定患者外周血低氧诱导因子-1α(HIF-1α),血管内皮生长因子(VEGF)及基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的水平。结果对于外周血CD133^+KDR^+EPC、CD133^+CD34^+EPC、CD34^+KDR^+EPC水平,重度OSA组>中度OSA组>轻度OSA组>对照组(均P<0.05);轻、中度OSA组的外周血ALDHloCD34^+KDR^+EPC水平高于对照组,重度OSA组低于其他3组(均P<0.05);血清HIF-1α、VEGF均是重度OSA组>中度OSA组>轻度OSA组>对照组,SDF-1α水平为重度OSA组<中度OSA组<轻度OSA组<对照组(均P<0.05)。结论 OSA患者可能都会诱导动员并招募大量无效EPC,其数量庞大,但直接参与修复内皮的ALDHloCD34^+KDR^+EPC并未增加,尤其对于重度OSA患者甚至有可能减少,OSA减弱了修复内皮的可能性,加重了内皮损伤,从而增加心血管事件的发生风险。

慢性脑缺血及急性缺血性脑卒中患者循环内皮祖细胞及其诱导因子的表达变化

目的探讨慢性脑缺血(CCH)及急性缺血性脑卒中(AIS)患者循环内皮祖细胞(EPCs)水平及血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、低氧诱导因子-1(HIF-1)的表达情况,比较CCH与AIS患者EPCs表达水平及其诱导因子的表达差异。方法四川省人民医院神经内科门诊就诊的CCH患者34例(CCH组),同期住院诊治的AIS患者31例(AIS组),对照组为同期健康体检者25例。收集患者临床资料;采用动脉自选标记(ASL)检查证实CCH组存在脑血流低灌注区;流式细胞学技术检测血液中EPCs的表达情况;酶联免疫吸附法检测血清中VEGF、SDF-1、HIF-1的表达量。结果AIS组吸烟率高于CCH组(P<0.05),CCH组及AIS组高血压病患病率高于对照组(P<0.05)。CCH患者脑缺血部位多见于额叶及半卵圆中心,且27例CCH患者为颅内多发脑组织缺血。26例AIS患者存在不同程度头颈部动脉狭窄和(或)闭塞改变。CCH组EPCs、VEGF、HIF-1表达高于对照组(P<0.05),SDF-1表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。AIS组EPCs、VEGF、HIF-1表达高于对照组,SDF-1表达低于对照组(P<0.05)。AIS组与CCH组比较,VEGF表达升高(P<0.05),EPCs、HIF-1、SDF-1表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论CCH患者脑缺血部位多见于额叶及半卵圆中心,且大部分CCH患者为颅内多发脑组织缺血。CCH患者与早期AIS患者EPCs升高,可能与VEGF及HIF-1升高有关。CCH向AIS早期转化过程中,EPCs的表达变化不明显,但其诱导因子VEGF已在发生变化。