猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10^(10)pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10^(10)pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对仔猪的细胞与体液免疫应答效果。结果表明:Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量极显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.01),Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD4^(+)/CD8^(+)显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.05),重组空载体腺病毒组和PBS对照组之间的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量及CD4^(+)/CD8^(+)差异不显著(P>0.05)。免疫后第28,35,42,49天,Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的抗猪附红细胞体特异性IgG抗体效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子IL-4和IFN-γ水平极显著高于重组空载体腺病毒组与PBS对照组(P<0.01),重组空载体腺病毒组与PBS对照组之间差异不显著(P>0.05)。说明猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗可以诱导仔猪产生强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

原核生物eno基因在系统进化中应用及水平转移分析

多基因系统发育研究方法是系统发育分析中的一个重要手段,基因树冲突已成为分子系统发育研究中日益突出的问题。烯醇化酶基因(eno)及其编码的蛋白广泛存在于五界系统中,烯醇化酶为糖酵解途径中重要酶类。文章选取原核生物已注释的eno基因序列进行了系统发育分析。对其中的138个模式菌株的eno基因序列进行系统发育分析和同源性搜索,发现19个模式菌株的eno基因是通过水平转移而来;并通过核苷酸组成、密码子偏好性和基因排列等基因特征分析,进一步验证了水平转移基因的外源性。结果表明:原核生物eno序列具有较高保守性,其大小适中,是研究原核生物系统发育的良好材料。文章在对基因水平转移的供体和受体菌株生活习性、进化历史以及烯醇化酶的结构和功能的研究过程中提供重要参考价值。

猪附红细胞体eno基因可视化LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速、便捷、可基层现场检测猪附红细胞体(M.suis)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究参考GenBank已登录的M.suis基因组(NC_015153),以其α-烯醇化酶(eno)基因为目的基因设计合成4条特异引物,经反应条件优化,初步建立了检测M.suis的LAMP方法,其内外引物比为1􀏑6,可在63℃,反应50 min时通过SYBR Green I染料直接经肉眼判定结果。利用该方法检测弓形虫、大肠杆菌、猪链球菌I型、牛源瑟氏泰勒虫和M.suis,结果显示均无交叉反应,特异性强;将新提取的重组质粒pMD-eno 10倍倍比稀释(100~10-7),利用本研究建立的LAMP方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对重组质粒pMD-eno最低检测限为30拷贝/μL,比普通PCR检测方法敏感度高100倍,敏感性高;利用建立的LAMP方法对同一时间和不同时间提取的M.suis基因组(101~106)进行组内组间重复试验,结果显示组内与组间检测结果均为阳性,重复性好。利用该方法对84份疑似感染M.suis的猪血液样品进行检测,结果显示LAMP检测结果与PCR方法检测结果一致,表明本研究建立的LAMP检测方法可应用于M.suis临床样品检测。本研究建立的LAMP方法操作简单、特异、灵敏和重复性好,经肉眼可判读结果,适合猪场M.suis感染的现场检测。

金黄色葡萄球菌wood46株eno基因的克隆及原核表达

为获得Eno的重组蛋白,采用PCR法从金黄色葡萄球菌wood46株基因组扩增eno基因,并连接到pMD18-T载体上,转化至BL21感受态细胞中;重组质粒经PCR及酶切鉴定后,送上海生工测序。将鉴定正确的质粒酶切回收产物与原核表达载体pET-32a连接,然后转化至BL21感受态细胞,对平板筛选的阳性质粒进行PCR和酶切鉴定。对鉴定正确的重组菌进行诱导表达并纯化。实验结果表明成功构建了pET32a-eno表达载体,并获得了该纯化蛋白。该实验结果为S.aureus亚单位疫苗研究奠定了一定的基础。

表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠(雌雄各半)随机分为3组(PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组),每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG1和IgG2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4+和CD8+含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG1和IgG2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4+和CD8+含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组(P<0.05)。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列(登录号:CP002525.1)设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用KpnⅠ和XhoⅠ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR^259中,构建PCR^259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR^259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法(IFTA)检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列(登录号:CP002525.1)同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR^259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR^259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR^259-ENO构建成功。

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验(IFTA)鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组:重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4^+和CD8^+含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×109 PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4^+、CD8^+含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组(P<0.05;P<0.01)。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。

基于ENO基因的猪附红细胞体病 PCR-ELISA检测方法的建立

为建立猪附红细胞体病的PCR-ELISA检测方法,试验根据猪附红细胞体ENO基因序列,设计合成1对分别标记生物素(BIOT)和地高辛(DIG)的引物,进行PCR-ELISA检测。通过对包被液的种类和浓度、结合抗体的反应条件、封闭条件、PCR产物的稀释度及显色时间等条件进行优化,确定阴性、阳性判定的阈值,并进行特异性、敏感性及重复性验证。结果表明:该方法与猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫等均无交叉反应;敏感性比常规PCR高10倍,最低检出量为1.77×10^6拷贝/μL;对40份猪血液样品的,阳性检出率为22.5%。该试验建立的方法具有特异、敏感、安全等优点,将为猪附红细胞体病的临床诊断提供更准确、实用的检测方法。

基于Prime-Boost免疫策略的猪附红细胞体eno基因免疫效果评价

为了评估猪附红细胞体eno基因核酸疫苗与重组腺病毒疫苗采用Prime-Boost免疫策略对小鼠的免疫效果,本研究应用pVAX1-eno核酸疫苗和Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗免疫接种小鼠,将20只BALB/c小鼠随机分为4组:Prime-Boost策略组、Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、pVAX1-eno核酸疫苗组及PBS对照组。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异性抗体、IgG_(1)、IgG_(2a)抗体水平及IFN-γ、IL-4细胞因子水平,三免后测定小鼠脾脏细胞中CD4^(+)、CD8^(+)的含量,对试验数据进行统计分析。结果显示,Prime-Boost策略组接种的小鼠血清中抗猪附红细胞体特异性抗体、IgG_(1)、IgG_(2a)抗体水平均显著高于Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组(P<0.05),极显著高于pVAX1-eno核酸疫苗组(P<0.01);Prime-Boost策略组的IL-4与IFN-γ细胞因子水平、CD4^(+)与CD8^(+)水平显著高于Ad5-M/eno疫苗组和pVAX1-eno核酸疫苗组(P<0.05)。试验结果表明,与猪附红细胞体Ad5-M/eno,PVAX1-eno单疫苗相比,采用Prime-Boost免疫策略更能显著提高小鼠体液免疫水平与细胞免疫水平。

猪附红细胞体eno基因PCR诊断方法的建立

为建立快速、准确的猪附红细胞体诊断方法,根据GenBank上发布的猪附红细胞体的eno基因序列,设计合成1对特异性引物,通过PCR退火温度筛选出最适温度,将PCR扩增产物进行克隆与测序,并进行特异性试验、敏感性试验及临床应用试验。结果表明:建立的PCR方法扩增出猪附红细胞体eno基因序列大小为170 bp,与GenBank中(序列号AB265823.1)的序列同源性为98%;建立的PCR方法特异性好、敏感性强,具有很好的临床应用价值,该方法为猪附红细胞体病的病原核酸诊断提供了有力支撑。

宁夏汉族人群eNOS基因3个SNP位点与原发性高血压相关性的研究

目的:探讨在宁夏地区汉族人群中eNOS基因3个SNP位点与原发性高血压(EH)的相关性。方法:采用PCR-RFLP方法对204例EH患者及219例健康个体eNOS基因rs2070744(T>C)、rs1800780(A>G)和rs3918181(A>G)共3个SNP位点检测。用χ2检验比较病例组-对照组间基因型频率、等位基因频率的差异,用SHEsis在线分析软件分析单倍型。结果:EH组和对照组间,rs1800780位点基因型频率的分布存在显著性差异(P<0.05)。rs2070744位点及rs3918181位点基因型频率及等位基因频率的分布均无显著性差异(P>0.05)。3个SNP位点共检出8种单倍型,其中单倍型TGA在对照组及EH患者中有统计学差异(P<0.05),且OR(95%CI)为1.549(1.116～2.150)。结论:单倍型TGA的出现可能会增加汉族EH的患病风险。

eNOS基因G894T突变位点与缺血性脑卒中的关系

目的 为了了解内皮型一氧化氮合成酶 (eNOS)基因G894T突变位点与中国人群缺血性脑卒中之间的关系。方法 我们利用PCR和分子杂交技术对北京地区 2 94例缺血性脑卒中患者及 2 80例非卒中对照的eNOS基因G894T突变位点进行了检测和分析。结果 G894T位点在两组人群中的分布均符合Hardy -Weinberg遗传平衡定律 ,但该位点基因型频率及等位基因频率在两组人群中分布无差异。结论 eNOS基因G894T突变不是中国人群缺血性脑卒中发病的遗传学危险因素。

宁夏回族人群eNOS基因多态性与原发性高血压关联性分析

目的探讨在宁夏地区回族人群中eNOS基因4个SNP位点与原发性高血压(EH)的关联性。方法采用PCR-RFLP方法对134例EH患者及115例健康个体eNOS基因rs2070744(T>C)、rs1799983(G>T)、rs1800780(A>G)和rs3918181(A>G)共4个SNP位点进行检测。EH组与对照组间基因型频率、等位基因频率的差异比较采用χ2检验,并采用SHEsis在线分析软件对单倍型进行分析。结果 EH组和健康对照组间,rs1800780位点和rs1799983位点基因型频率的分布差异有统计学意义(P<0.05)。rs1799983位点等位基因频率的分布差异有统计学意义(P<0.05),其等位基因G的频率在EH组低于健康对照组,且OR值为3.851(95%CI:2.236～6.631)。4个SNP位点共检出15种单倍型,其中单倍型CGAG、TTAG、TGGG、TTGG、TTGA在宁夏回族健康人群及EH患者中差异有统计学意义(P<0.05)。单倍型CGAG、TGGG的OR值为0.352、0.600,95%CI小于1;单倍型TTAG的OR为2.689,95%CI大于1。结论 rs1799983位点等位基因G为宁夏回族人群易患EH的危险因子,单倍型CGAG与TGGG可降低回族EH的患病风险,而单倍型TTAG可增加回族EH的患病风险。

中国人群eNOS基因内含子13微卫星多态性的初步研究

目的 :为研究eNOS基因内含子 13上的微卫星序列与妊高症的相关性。方法 :采用PCR-PAGE与银染相结合的方法 ,研究其多态性。结果 :得到含有该微卫星序列的DNA片段。结论 :证实在中国人群中eNOS基因内含子 13上的确存在一个CA重复的多态性微卫星序列 ,从而为研究该位点与妊高症的相关性提供了技术支持和理论依据。

利用PCR-RFLP分析eNOS基因exon7BanⅡ酶切位点的遗传多态性

目的 :探讨内皮型一氧化氮合酶基因多态性与妊高征的相关性。方法 :应用PCR -RFLP技术检测了 12例正常女性的内皮型一氧化氮合酶基因第 7外显子。结果 :发现 12例正常女性中有 4例的基因型是eNOS/GG ,有 8例的基因型是eNOS/GT ,未检测到eNOS/TT型的个体。等位基因A1(eNOS/G)的频率为 66 7% ,等位基因A2 (eNOS/T)的频率为 33 3%。结论 :广东女性人群存在内皮型一氧化氮合酶第 7外显子BanⅡ酶切位点遗传多态性。

eNOS基因第7外显子894G→T多态与糖尿病肾病合并高血压的相关性研究

目的 探讨内皮细胞型一氧化氮合酶 (eNOS)基因第 7外显子 894位点多态性与糖尿病肾病合并高血压的相关性。方法 随机选择研究对象为单纯糖尿病 (DM )患者 5 2例 ,平均年龄 (6 6 .3± 7.9)岁 ,单纯糖尿病肾病 (DN)患者 4 5例 ,平均年龄 (6 5 .9± 6 .7)岁 ,糖尿病肾病合并高血压 (DN +HP)患者 5 0例 ,平均年龄 (6 5 .9± 6 .8)岁。运用聚合酶链反应限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术扩增eNOS基因第 7外显子的DNA片段 (2 4 8bp) ,以限制性内切酶BanⅡ进行酶切消化 ,2 %的琼脂糖电泳分离PCR产物。各组间等位基因频率及基因型频率的比较用 χ2 检验 ,危险因素分析用Logistic回归分析。结果 DN组T等位基因和TG基因型频率显著高于单纯DM组 (χ2 =7.2 0 ,P <0 .0 5 ;χ2 =9.17,P <0 .0 5 ) ,DN合并高血压组T等位基因及TG基因型频率高于DN组 ,但差异无显著性 (χ2 =0 .4 4 ,P >0 .0 5 ;χ2 =0 .6 1,P >0 .0 5 )。多因素Logistic回归分析发现 :收缩压 (SBP)、糖化血红蛋白 (HbA1c)、甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)、eNOS基因第 7外显子 894G→T突变是DN的独立危险因素。结论 eNOS基因第 7外显子 894G→T多态与糖尿病肾病有关。T等位基因可能是中国人 2型糖尿病患者易患DN的独立危险因素。eNOS基因第 7外显?

eNOS基因转染预防静脉移植血管再狭窄

目的 应用含牛内皮型一氧化氮合成酶 (e NOS)基因重组腺病毒 (Ad5 CMVNOS )转染静脉移植血管 ,观察 e NOS基因预防静脉移植血管再狭窄的作用。 方法 将 2 1只杂种犬分为 3组 ,手术对照组、Ad5 CMVL ac- Z(含大肠杆菌 β半乳糖苷酶基因重组腺病毒 )对照组和 Ad5 CMVNOS 干预组。在犬颈静脉、颈动脉旁路血管移植术中分别应用 Ad5 CMVNOS 病毒液或 Ad5 CMVL ac- Z病毒液常温浸泡法感染静脉移植血管 30分钟 ,术后 2 8天病理切片观测移植血管新内膜增生状况。 结果 与正常犬颈外静脉相比 ,手术对照组、Ad5 CMVL ac- Z对照组和Ad5 CMVNOS 干预组颈外静脉移植血管内膜 /中膜比较均有不同程度增加 (P<0 .0 5 ) ,但 Ad5 CMVNOS 组内膜 /中膜比显著低于另外 2个对照组 (P<0 .0 5 ) ,新内膜增生明显减轻。 结论 Ad5 CMVNOS 感染静脉旁路移植血管对预防再狭窄有一定作用。

eNOS基因治疗对肝硬化大鼠肝窦容积的影响

目的:观察以eNOS基因导入肝硬化门静脉高压症大鼠后,肝内eNOS表达和肝窦容积的变化;探讨eNOS基因转染对肝窦容积的影响。方法:①建立CC14肝内型肝硬化大鼠模型,分别取10只肝硬化大鼠和10只正常大鼠肝组织,用免疫组化、图像分析系统测定eNOS含量和肝窦容积;②取30只肝硬化大鼠,随机分成3组:内eNOS治疗组(n=10)、Tris对照组(n=10)和空质粒对照组(n=10)。分别经门静脉注射脂质体-eNOS质粒、Tris缓冲液脂质体-空质粒5d后,用RT-PCR和免疫组化方法检测3组大鼠肝内eNOSmRNA、eNOS含量和肝窦容积;结果:①硬化肝内eNOS含量和肝窦容积分别为(3.81±1.09)%和(3.51±0.72)%,均显著低于正常对照组的(14.78±3.06)%和(9.32±1.05)%(P<0.01);两组大鼠肝内eNOS含量与肝窦容积之间均呈显著正相关,相关系数r分别为0.676(P<0.05)和0.703(P<0.05)。②经门静脉注射各组之规定内容5d后,eNOS基因治疗组大鼠肝内eNOSmRNA、eNOS含量和肝窦容积分别为(1.22±0.14)U、(17.38±4.62)%和(5.77±1.49)%,均显著高于Tris处理组或空质粒处理组(P<0.01);3组的eNOS含量与肝窦容积之间均呈显著正相关,r分别为0.799(P<0.01)、0.767(P<0.01)和0.748(P<0.05)。结论:肝硬化时,因肝窦内皮细胞受损,肝内eNOS含量减少,肝内NO产量减少。

高血压患者eNOS基因变异与饮酒间交互作用

目的 探讨内皮型一氧化氮合成酶 (eNOS)基因第 7外显子G894T(Glu2 98Asp)变异与饮酒之间交互作用在高血压患病中的意义。方法 以某工厂人群中筛检出的、未经药物系统治疗的 116名高血压患者及 136名血压正常者为研究对象 ;运用PCR -限制性片段长度多态性检测G894T变异 ;用相加模型分析G894T变异与饮酒之间的交互作用 ;用人群归因危险度百分比计算人群中的病因分值。结果 G894T变异与饮酒之间对高血压患病具有正交互作用 ;归因交互效应为 3 6 9;归因交互效应百分比为 4 8 6 8% ;纯因子间归因交互效应百分比为 5 6 0 8%。用多元Logistic回归调整年龄、性别、吸烟、体重指数后 ,G894T变异与饮酒之间对高血压患病仍具有正交互作用。调整上述混杂因素后 ,归因交互效应为 1 13;归因交互效应百分比为 19 0 9% ;纯因子间归因交互效应百分比为 2 2 97%。在给定条件下计算的人群归因危险度百分比约为 10 %～ 15 %。结论 eNOS基因G894T变异与饮酒之间交互作用在该研究人群高血压患病中具有重要意义 ;在仅仅对具有G894T变异与饮酒同时存在的这一小部分人群中控制饮酒可明显降低一般人群高血压患病危险。