猫爪草提取物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标

利用双向电泳技术,对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术,对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得5个明确的肽质量指纹图谱.通过数据库检索,确定这5个蛋白质分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶、烯酰-CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60 kD的分子伴侣2.其中前4个分子是首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动.该结果有助于了解猫爪草提取物对结核分枝杆菌生理的影响,为进一步确定中药猫爪草提取物对结核分枝杆菌的作用靶标和机理提供了基础.

烯酰辅酶A水合酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人烯酰辅酶A水合酶(ECH1)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blotting及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAPXR表达文库筛选鉴定抗原。结果获得1株可稳定分泌抗人ECH1mAb的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),该mAb可用于ELISA检测、Western blotting、免疫组化和免疫沉淀实验。结论成功制备了抗人ECH1的mAb,为ECH1的研究提供了有力的工具。

猪ECH1基因部分序列的遗传变异分析

为了进一步研究烯脂酰辅酶A水解酶1(enoyl CoA hydratase,ECH1)基因的生物学功能,研究采用克隆测序结合PCR-RFLP的方法分析了民猪ECH1基因的部分DNA序列,并对其中的1个点突变进行了3个猪种内的基因型频率和基因频率计算。结果表明:研究所检测的ECH1基因序列与网上已有序列相比存在8个单核苷酸多态性(SNPs)位点,其中有2个造成酶切位点的改变;民猪和大白猪在PCR-RFLP-BamHⅠ位点的A、B基因频率均接近0.5,而长白猪B为优势等位基因。

家蚕微孢子虫与家蚕ECH1和GAPDH蛋白的相互作用

【目的】在分子层面上研究家蚕微孢子虫Nosema bombycis与家蚕Bombyx mori蛋白的相互作用,初步探讨家蚕微孢子虫向家蚕细胞能量中心靠近的原因。【方法】采用Far-western blot分析与家蚕微孢子虫具有相互作用的家蚕中肠蛋白,质谱鉴定筛选出候选蛋白。PCR扩增候选蛋白的基因,连接到p ET30a载体并转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞培养,测序选取正确的3个重组质粒,转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中诱导表达候选蛋白,亲和层析柱纯化候选蛋白,制备多克隆抗体。用免疫共沉淀和间接免疫荧光技术验证候选蛋白与家蚕微孢子虫的相互作用。【结果】Far-western blot筛选到的anti-SWP9和anti-SWP5抗体与感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠总蛋白的PVDF膜孵育,分别在26 k D和34 k D处检测到一条特异条带,说明家蚕微孢子虫与26 k D和34 k D的家蚕中肠蛋白发生了相互作用。对质谱鉴定结果进行蛋白质的分子量、肽段数以及功能的分析,筛选出与家蚕微孢子虫相互作用的候选家蚕蛋白烯酰辅酶A水合酶(ECH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HCDH)。利用制备的能够特异识别ECH1,GAPDH和HCDH 3种蛋白的多克隆抗体anti-ECH1,anti-GAPDH和anti-HCDH进行免疫共沉淀,证实了家蚕微孢子虫与家蚕中肠蛋白ECH1和GAPDH具有相互作用;间接免疫荧光分析结果进一步说明GAPDH能与家蚕微孢子虫特异性结合。【结论】家蚕微孢子虫可以和家蚕蛋白ECH1和GAPDH特异性结合。由于ECH1是定位于线粒体膜上的脂肪酸β-氧化的关键酶,GAPDH是糖酵解途径的关键酶,推测家蚕微孢子虫可能通过和家蚕ECH1和GAPDH的相互作用,在空间上靠近宿主细胞的线粒体和糖酵解途径,便于摄取宿主细胞脂肪酸β-氧化和糖酵解途径产生的中间产物和ATP,满足家蚕微孢子虫的物质和能量需求。

烯酰辅酶A水合酶短链1、表皮生长因子及低糖环境促进肝癌细胞侵袭转移

目的研究肝细胞癌(HCC)组织中能量代谢相关酶的表达及对肝癌细胞侵袭能力的影响,探讨烯酰辅酶A水合酶短链1(ECHS1)、AMP蛋白激酶(AMPK)、脂肪合成酶(FAS)、乙酰CoA羧化酶(ACC)等相关酶及低糖环境在HCC发生发展过程中的作用。方法选取解放军第一七五医院2015年6月-2016年6月经手术切除的32例HCC患者肝癌及癌旁组织,通过免疫组化技术,检测不同分化程度肝癌及癌旁组织中能量代谢过程中关键酶FAS、ACC及AMPK等表达情况。构建两组肝癌细胞株,对照组:转染空白对照质粒的肝癌细胞Huh7-plv、HepG2-PU6;实验组:转染小干扰RNA(siRNA)的肝癌细胞株Huh7-siECHS1、HepG2-siECHS1。应用Transwell小室实验观察ECHS1及低糖培养和加入表皮生长因子(EGF)等不同营养条件对肝癌细胞侵袭能力的影响。计量资料组间比较采用t检验;计数资料组间比较采用χ~2检验。结果免疫组化结果显示,肝癌细胞中ACC、AMPKβ表达高于癌旁组织,差异均有统计学意义(21/11 vs 7/25,χ~2=12.44,P<0.05;31/1 vs 26/6,χ~2=4.68,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,在正常营养条件(Huh7-plv-N、HepG2-PU6-N)及加入EGF的正常营养条件(Huh7-plv-N-EGF、HepG2-PU6-NEGF)的肝癌细胞侵袭数均明显大于相应干扰ECHS1后(Huh7-siECHS1-N、HepG2-siECHS1-N、Huh7-siECHS1-N-EGF、HepG2-siECHS1-N-EGF)的侵袭细胞数(t值分别为6.93、6.51、7.55、4.93,P值均<0.05);低糖培养环境(Huh7-plvLowGlu、HepG2-PU6-LowGlu)及加入EGF的低糖培养环境(Huh7-plv-LowGlu-EGF、HepG2-PU6-LowGlu-EGF)的肝癌细胞侵袭数亦大于相应干扰ECHS1后(Huh7-siECHS1-LowGlu、HepG2-siECHS1-LowGlu、Huh7-siECHS1-LowGlu-EGF、HepG2-siECHS1-LowGlu-EGF)的侵袭细胞数,差异均有统计学意义(t值分别为9.52、5.80、20.52、8.80,P值均<0.05)。表明不同营养条件下,干扰ECHS1后肝癌细胞Huh7、HepG2的侵袭能力均明显降低。此外,加入EGF后(Huh7-plv-N-EGF、HepG2-PU6-N-EGF)与正常营养条件(Huh7-plv-N、HepG2-PU6-N)相比,穿透小室的细胞数明显增多(t值分别为4.44、3.17,P值均<0.05);而低糖条件下(Huh7-plv-LowGlu、HepG2-PU6-LowGlu)与正常营养环境相比,发生侵袭的细胞数有所增加,但差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论 ECHS1、EGF可明显增强肝癌细胞侵袭转移能力,低糖饥饿条件亦可对肝癌细胞侵袭能力起到一定促进作用。

EHHADH是肝细胞癌脂肪酸代谢通路的关键基因:基于转录组分析

目的基于多数据库数据探索肝细胞癌(HCC)发生发展的驱动基因并挖掘HCC治疗的新生物靶点。方法采用从TCGA、GEO和ICGC数据库中获取的858例HCC组织数据与493例癌旁组织数据(共1351例转录组和基因组数据),运用GSEA筛选HCC与癌旁的差异通路,进而筛选差异通路中显著富集的基因,获得Hub基因3-hydroxyacyl CoA脱氢酶(EHHADH)。基于TCGA的HCC数据集分析与EHHADH转录组水平下调相关的基因突变,发现TP53突变最显著相关。利用相关性分析探究TP53突变导致EHHADH表达下调的机制。基于Metascape数据库预测EHHADH参与HCC发展的信号通路,发现与铁死亡信号通路显著相关。对30例HCC癌组织及配对的癌旁正常组织进行免疫组化染色,验证EHHADH的表达情况。结果三个HCC数据集均显示EHHADH在癌组织中相对于癌旁组织显著低表达(P<0.05),且和肝细胞去分化程度显著相关(P<0.01)。TCGA的HCC数据集体细胞突变景观分析显示HCC患者基因组中TP53突变率比例最高。EHHADH上游基因PPARGC1A转录组水平在TP53突变的HCC患者组中较未突变组显著下调(P<0.05),并与EHHADH表达水平相关。GO和KEGG富集分析结果显示EHHADH参与到肿瘤脂肪酸代谢通路中。免疫组化结果验证HCC组织中EHHADH表达水平下调,且其表达水平与肝细胞去分化程度及铁死亡进程相关。结论HCC组织中TP53突变可能诱导EHHADH上游基因PPARGC1A表达异常从而下调EHHADH表达。EHHADH在HCC癌组织中低表达与HCC癌组织的去分化程度加重及出现铁死亡逃逸现象密不可分,有可能成为HCC潜在治疗靶点。

水稻烯酰辅酶A水合酶的功能预测分析

水稻潜根线虫是一类寄生于水稻根部的迁移性内寄生线虫,广泛分布于各类水稻田中,成为严重危害水稻的寄生线虫,其中水稻细尖潜根线虫是江西省最严重的水稻潜根线虫之一。目前培育抗病品种是防治水稻潜根线虫病最为经济、有效的措施。通过转录组分析水稻细尖潜根线虫侵染的和未受水稻细尖潜根线虫的感病水稻品种‘霸王鞭’根组织基因表达情况,筛选出差异表达显著上调基因OsECH1,并对OsECH1蛋白及其同源蛋白进行系统发育分析。结果表明:OsECH1蛋白与其他同源蛋白具有相同的保守结构域PLN02874,属于ECH家族。同时发现在水稻‘日本晴’中有5个同源基因,其中OsECH1基因位于染色体1上;克隆获得OsECH1基因全长并利用同源重组技术构建重组表达载体,通过农杆菌转化获得转基因水稻;经RT-qPCR分析该基因表达水平对水稻细尖潜根线虫侵染的影响。结果表明,在水稻中过表达OsECH1基因会减少水稻细尖潜根线虫的侵染,沉默OsECH1基因会增加水稻细尖潜根线虫的侵染;OsECH1蛋白亚细胞定位于细胞核中;通过His-tag pull down分析,该蛋白可能与5种防御相关蛋白互作。5种防御相关蛋白分别属于vATP-synt_E家族蛋白、Ricin-B家族蛋白、过氧化氢酶和B_lectin家族。RT-qPCR结果表明OsECH1对这5种蛋白均具有调控作用,该结果为进一步揭示OsECH1基因的功能提供基础。上述结果不仅为了解OsECH1基因的分子机制奠定基础,也为进一步阐述水稻与潜根线虫的互作机制提供新方向。

线虫烯脂酰CoA水合酶的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析

生物体β-氧化循环是脂肪酸氧化分解的主要途径,许多代谢疾病都与其密切相关。线虫β-氧化循环与人类相似,但与其相关的研究报道却很少。线虫基因C32E8.9编码的蛋白被WormBase命名为烯脂酰CoA水合酶(WormBase ID:CE29693),被推测具有催化β-氧化循环第二步反应的功能。作者将C32E8.9基因克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌中获得高效表达,并分别纯化了母体蛋白以及硒代蛋白衍生物。多角度静态光散射实验表明该蛋白的聚合状态为三聚体。该蛋白在沉淀剂2-甲基-2,4-戊二醇的作用下形成可供衍射分析的六棱柱形状晶体,空间群为P21,晶胞参数为a=79.0,b=82.4,c=79.2,α=γ=90.0°,β=120°,数据分析表明该晶体非单晶,是一种罕见的蛋白质"三晶"——包含三套晶格。

烯酯酰辅酶A水解酶1基因在小鼠肝癌细胞株中的表达及其与增殖和迁移能力的关系

目的 研究烯酯酰辅酶A水解酶1（ ECH1）在小鼠肝癌高、低淋巴转移Hca-F/Hca-P细胞株中的表达及ECH1基因表达下调后对Hca-F细胞增殖和迁移能力的影响.方法 采用免疫荧光方法检测ECH1在小鼠肝癌细胞株中的表达.构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ECH1表达载体,稳定转染至高淋巴转移Hca-F细胞中干扰ECH1基因的表达,通过CCK8法检测肿瘤细胞的增殖能力,Transwell小室检测肿瘤细胞的迁移能力,并应用流式细胞仪检测肿瘤细胞的细胞周期情况.结果 ECH1在小鼠肝癌细胞株中主要表达于细胞质,且ECH1在Hca-F细胞的表达强于其在Hca-P细胞的表达.ECH1表达下调后,Hca-F细胞的增殖能力明显下降.Transwell小室检测穿膜细胞数pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ECH1转染Hca-F组（27.07±17.49）较阴性对照组（72.38±18.83）和Hca-F组（59.06±30.33）明显减少,细胞周期S期pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ECH1转染Hca-F组（86.1％）较阴性对照组（75.8％）和Hca-F组（66.2％）停留细胞数明显增多,G1期pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ECH1转染Hca-F组（9.4％）较阴性对照组（24.2％）和Hca-F组（30.3％）停留细胞数明显减少.结论 ECH1可能在肿瘤淋巴转移中发挥作用,抑制ECH1的表达可有效降低体外高淋巴转移肿瘤细胞的增殖和迁移能力.

运动对ApoE基因敲除小鼠骨骼肌脂代谢及PPAR-α mRNA表达的影响

目的 观察运动对胰岛素抵抗小鼠骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）及靶基因脂酰辅酶A氧化酶（ACO）、烯酰辅酶A水解酶/L-3羟-CoA脱氢酶（EHHADH）mRNA表达的影响,并初步探讨运动改善脂代谢的可能机制.方法 将20只雄性ApoE基因敲除小鼠随机分为高脂组及运动组,高脂组小鼠给予高脂饮食喂养,运动组小鼠在高脂饮食基础上增加游泳训练,另选取C57BL/6J小鼠作为对照组.经干预12周后,测定各组小鼠空腹血脂、血糖及胰岛素浓度,并计算胰岛素抵抗指数;同时取各组小鼠腓肠肌进行电镜超微结构观察,采用RT-PCR方法检测各组小鼠骨骼肌中PPAR-α、ACO及EHHADH mRNA水平.结果 通过电镜观察发现,高脂组可见肌细胞线粒体水肿、肌膜下水肿、肌原纤维间水肿,伴有肌溶解灶,该组小鼠血脂（总胆固醇、低密度脂蛋白、游离脂肪酸）、空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数均较对照组明显升高（均P ＜0.05）,骨骼肌中PPAR-α、ACO及EHHADH mRNA表达均较对照组明显下调（均P＜0.05）.运动组小鼠经游泳干预后,发现其肌细胞肌原纤维间有轻度水肿,肌纤维排列整齐,未见肌溶解及肌膜下水肿;血脂水平较高脂组明显降低（均P＜0.05）,高密度脂蛋白较高脂组明显升高（P＜0.05）;空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数较高脂组明显降低（均P＜0.05）,骨骼肌中PPAR-α、ACO及EHHADH mRNA表达较高脂组明显上调（均P＜0.05）.结论 游泳运动可显著改善ApoE基因敲除小鼠脂代谢紊乱及胰岛素抵抗,其治疗机制可能与上调骨骼肌中PPAR-α,进一步激活其下游靶基因ACO及EHHADH,从而提高脂肪酸氧化代谢能力有关.

烯酰基-辅酶A水合酶催化机理的理论研究

采用DFT方法研究了烯酰基-辅酶A(ECH)催化的4-(N,N-二甲氨基)-肉桂酰-辅酶A(DAC-CoA)和巴豆酰基-辅酶A(Crotonyl-CoA)水合反应.计算表明:水合反应以分步机理进行,经历一个烯醇负离子中间体.Glu164残基作为唯一的催化碱/酸参与水合反应,而Glu144虽然没有直接参与反应,但是它能通过氢键作用诱使水分子以合适的朝向活化底物.Crotonyl-CoA底物的水加成活性高于DAC-CoA.Ala98和Gly141与底物羰基之间的氢键作用既有利于底物的准确结合,也能有效稳定反应中形成的过渡态和中间体.另外,Glu144和Glu164周围的氢键网络对于合理维持活性位点排布进而有效促进底物活化也很重要.

短链烯酰辅酶A水合酶1基因突变导致线粒体短链烯酰辅酶A水合酶1缺乏症1例

目的:总结1例短链烯酰辅酶A水合酶1(ECHS1)基因导致线粒体短链烯酰辅酶A水合酶1缺乏症(ECHS1D)患儿的临床特征及基因突变特点。方法:回顾性分析2021年1月就诊于徐州市儿童医院神经内科的1例ECHS1D患儿的临床特点及基因检测结果,并通过检索国内外相关文献对该疾病的临床特征进行复习。结果:患儿男性,年龄6个月4 d,急性起病,临床以肢体活动障碍为主要表现。患儿运动发育迟缓,竖头尚可,不能翻身、独坐,不能追视,不能逗笑出声,四肢肌张力增高。入院检查示血乳酸水平升高至6.2 mmol/L,提示代谢性酸中毒。头颅磁共振成像(MRI)示双侧基底节区异常信号,左侧大脑半球脑膜异常强化。全外显子组测序发现该患儿ECHS1基因存在复合杂合突变,分别为c.563C>T(p.A188V)和c.5C>T(p.A2V),患儿父亲携带c.563C>T突变,母亲携带c.5C>T突变,均为错义突变。结论:ECHS1基因以错义突变为主,大部分为复合杂合突变,少部分为纯合突变。ECHS1基因突变导致线粒体ECHS1D常累及婴幼儿,发病相对较早,临床表现为代谢性酸中毒、运动发育迟缓、肌张力障碍等,头颅MRI可存在基底节区异常信号。对具有类似临床表现和MRI基底节异常信号的病例,应考虑基因检测明确诊断。