Contruction of the Genetic Engineering Strain Expressed Nontoxic ST_1-LT_B Fusion Protein Against Enterotoxigenic Eschenichia coli

Thermostable enterotoxinⅠ(ST1) mutant genes and thermolabile enterotoxin B subunit (LTB)genes were amplified by PCR from plasmids of Eschenichia coli C83902. The recombinantexpression plasmid pZST3LTB containing ST1-LTB fusion gene was constructed by recombinantDNA technique and then transformed into Escherichia coli BL21(DE3). The ST1-LTB fusionprotein was highly expressed in recombinant strain BL21(DE3)(pZST3LTB) and the fusionprotein was about 38.53% of total cellular protein by SDS-PAGE and thin-layer gelscanning analysis. More important, mice immunized with crude preparation containing thefusion protein inclusion bodies or inactivated recombinant strain produced antibodiesthat were able to recognize ST1 in vitro. These sera antibodies were able to neutralizethe biological activity of native ST1 in the suckling mouse assay. Hence the ST1-LTBfusion protein was nontoxic and immunogenic, the constructed recombinant strain BL21(DE3)(pZST3LTB) could be used as a candidate of vaccine strain.

金黄色葡萄球菌临床分离株肠毒素基因的调查分析

目的检测临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)肠毒素基因,了解肠毒素基因的携带情况与SA耐药的关系。方法采用聚合酶链反应检测SA mecA基因和肠毒素基因,了解肠毒素基因在SA中分布的状况,并对其进行耐药性分析。结果 67株甲氧西林耐药的SA(MRSA)和57株甲氧西林敏感的SA(MSSA)肠毒素基因携带率(100%vs 83.5%)无明显差异(χ2=0.203,P>0.05)。肠毒素基因检出率为93.5%(116株),其中SEA、SEB、SEC、SED和SEF的检出率分别为90.5%、6.9%、61.3%、5.2%和25.9%,未检测出SEE基因。同时检出2种及2种以上的肠毒素基因的菌株有78株(67.2%),以携带SEA+SEC、SEA+SEF和SEA+SEC+SEF基因为主,检出率分别为33.6%、7.8%和13.8%。与携带一种肠毒素基因的菌株耐药率相比,携带多种肠毒素基因的菌株耐药率呈上升趋势,其中携带SEA+SEC+SEF的菌株对复方新诺明的耐药率为75.0%,高于单独携带SEA(28.6%)、SEA+SEC(38.7%)的耐药率,具有统计学差异(P<0.05)。携带SEA+SEC+SEF、SEA+SEF、SEA的菌株对阿米卡星耐药率分别为75.0%、77.0%和21.5%,前两者与携带SEA的菌株相比有显著差异(P<0.05)。结论临床分离的SA中携带多种肠毒素基因的菌株在耐药率上高于只携带一种肠毒素基因的菌株,提示肠毒素在SA耐药中起重要作用。

6种食品防腐剂对金黄色葡萄球菌抑菌效果及肠毒素基因表达的影响

目的:探索6种食品防腐剂——亚硝酸盐、苯甲酸钠、ε-聚赖氨酸、壳聚糖、茶多酚、Nisin对1株引起食物中毒的金黄色葡萄球菌SA003的抑菌作用,以及对该菌株所含不同肠毒素基因在m RNA水平表达的影响。方法:按照GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》限量标准的质量浓度,分别添加6种不同的防腐剂在金黄色葡萄球菌SA003初始接菌量约为105 CFU/m L的TSB液体培养基中,37℃培养24 h后进行菌落计数;同时收集菌体用于RNA提取,将提取的RNA进行反转录后,采用荧光定量聚合酶链式反应方法检测各肠毒素基因在m RNA水平上的相对表达量。结果:在国标最大限量条件下,不同添加剂对金黄色葡萄球菌SA003的抑菌作用强弱顺序分别为:Nisin>茶多酚>壳聚糖>ε-聚赖氨酸>苯甲酸钠>亚硝酸盐。6种防腐剂均能抑制肠毒素sea、sed、seg、sei、selj、selm、selr和selu基因在转录水平上的表达,但作用效果存在差异。结论:在TSB液体培养基中添加一定剂量的防腐剂不仅能抑制金黄色葡萄球菌的生长,还能够显著降低肠毒素基因的表达量。

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布与时序性表达

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用PCR技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,使用反转录荧光定量PCR研究各肠毒素基因在细菌生长周期中的表达水平变化。【结果】除see、ses和set外,其余8种肠毒素基因在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中均有检出,且sei和seg的检出率最高(27.45%)。各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致,均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达量以及不同菌株中同一肠毒素基因的相对表达量均差异较大。【结论】本文系统研究了肠毒素基因在食源性金黄色葡萄球菌中的分布,并探究了肠毒素基因的时序性表达规律,对金黄色葡萄球菌毒力机制研究与食品质量安全控制具有参考意义。

金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布的研究

为了研究g型肠毒素基因(SEg)i、型肠毒素基因(SEi)在金黄色葡萄球菌菌株中的分布状况,本试验以分离自人化脓组织、生牛乳等8种不同来源的371株金黄色葡萄球菌菌株作为研究对象,利用PCR技术对肠毒素基因的分布进行检测。结果表明:267株金黄色葡萄球菌检出含有肠毒素基因,总检出率为71.97%。其中SEg基因的总检出率为67.93%,SEi基因的总检出率为57.68%。各来源间金黄色葡萄球菌肠毒素的检出率不同,且同一来源的菌株其SEg和SEi的检出率也不同,表明不同来源以及不同肠毒素的基因型在金黄色葡萄球菌中的分布存在差异。

大肠杆菌肠毒素的基因融合及其免疫原性的研究

应用重组基因工程技术，将热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ）基因与含有部分前体的耐热肠毒素（ｐｒｏ－ＳＴ）基因融合在一起，构建了表达ＬＴ－Ｂ／ｐｒｏ－ＳＴ融合蛋白的重组质粒．该融合蛋白不仅保持结合神经节苷脂（ＧＭ１）的能力，而且具有热敏肠毒素和耐热肠毒素的抗原性．乳鼠实验证明，融合蛋白虽然含有野生耐热肠毒素，但不具耐热肠毒素的生物毒性．腹腔免疫和鼻饲免疫均能激发产生抗ＥＴＥＣ两种肠毒素的抗体．

金黄色葡萄球菌食品和病人分离株肠毒素基因和耐药性比较

目的:对金黄色葡萄球菌食品(不含生牛奶)分离株和病人分离株的肠毒素基因进行分型和耐药性检测,比较两种分离菌株的肠毒素基因分布和耐药性差异。方法:用国标方法分离鉴定金黄色葡萄球菌,VITEK32生化验证,PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因(肠毒素SEA-SEJ基因),VITEK32测定分离菌株抗生素的耐药性。结果:从病人分离的80株金黄色葡萄球菌检测到9种基因。肠毒素基因携带率为85.0%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占76.3%,含传统肠毒素基因(SEA-SEE)的菌株占43.8%,有新发现肠毒素基因(SEG-SEJ)的菌株占71.3%。从食品中分离的51株金黄色葡萄球菌检测到7种肠毒素基因。肠毒素基因携带率为68.7%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占21.6%。有SEA基因的占27.5%,含其它传统的毒素基因类型(SEB-SEE)基因的菌株占23.5%,携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI的菌株只占9.8%。金黄色葡萄球菌病人分离株与食品分离株的耐药谱和耐药率有较大差异。结论:金黄色葡萄球菌食品分离株和病人分离株的肠毒素基因分布不同,其耐药性有明显区别。

大肠杆菌热敏肠毒素和耐热肠毒素基因融合及其免疫原性研究

采用基因工程技术将编码大肠杆菌热敏肠毒素亚单位(LTB)基因和耐热肠毒素(ST)基因进行体外重组,得到的融合基因能在大肠杆菌中表达。重组菌株免疫动物后,均能诱发产生抗LT和抗ST抗体。实验结果表明,LT/ST融合蛋白不仅保持了LTB的免疫原性和与神经节苷酯GM1的结合能力,而且也赋予本来没有免疫原性的ST免疫原性,并极大地降低了ST的生物毒性,为构建理想的致腹泻大肠菌苗奠定了基础。

多重PCR检测金葡菌肠毒素基因型的研究

目的 应用多重聚合酶反应 (PCR) ,建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素 (SE)基因方法。方法 用溶菌素和蛋白酶K制备模板DNA ,用多重聚合酶链反应扩增的方法 ,对临床分离的金黄色葡萄球菌 13 0株进行扩增。结果 金黄色葡萄球菌肠毒素血清型A(SEA)阳性的占 2 3 1% (3 0 /13 0 ) ,血清型B(SEB)阳性的占 43 1% (56/13 0 ) ,血清型C(SEC)阳性的占 11 6% (15/13 0 ) ,血清型D(SED)阳性的占 6 12 % (7/13 0 ) ,血清型EA(SEE)阳性的占 2 3 1% (3 /13 0 ) ;femA基因片段在多重PCR中作为内部参照避免了假阴性结果的出现。结论 多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因型 ,具有敏感、快速、特异的特点 。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立与应用

目的建立一种快速准确定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。方法以femB、SEA基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A的靶序列，设计合成引物和TaqMan探针；收集腹泻患者大便标本分离的金黄色葡萄球菌68株，并定量检测其肠毒素A。结果TaqMan探针荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球和肠毒素A的灵敏度均为1．0×10^2拷贝。68株金黄色葡萄球菌中检出产肠毒察A菌株11例（16．2％，11／68），CT值为13．5—20．6。结论TaqMan探针荧光聚合酶链反应能够准确快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A。

一起食物中毒金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测

目的:检测从食物中毒中分离的金黄色葡萄球菌的肠毒素基因,明确肠毒素的基因型。对所分离的金黄色葡萄球菌进行药敏试验,检测其耐药性。方法:应用PCR扩增金黄色葡萄球菌SEA-SEJ基因,电泳检测扩增结果;用VITEK32检测药敏结果。结果:检测到金黄色葡萄球菌的肠毒素基因SEG和SEI,菌株的耐药性不强。结论:金黄色葡萄球菌的肠毒素SEG和SEI可能是这起食物中毒的因子。

沙门菌肠毒素基因克隆及序列分析

研究常见的不同血清型沙门菌肠毒素(stn)基因核苷酸序列之间的差异及其分布情况。根据沙门菌的stn核苷酸序列设计一对引物,应用PCR技术,分别对肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆及序列分析,并用所设计的引物检测7种血清型沙门菌(42株)。结果显示,3种沙门菌经PCR均扩增出749 bp的特异条带,DNA序列分析证实,沙门菌的stn核苷酸序列比较保守,42株沙门菌stn的检出率为100%。本试验成功克隆出沙门菌的stn,调查其在不同血清型沙门菌中的分布及序列分析,为进一步研究stn致病机理及研制减毒沙门菌活菌疫苗奠定了基础。

3种肠毒素基因在苏云金芽孢杆菌中的分布

采用PCR方法对引自美国俄亥俄州立大学芽孢杆菌遗传保存中心(BGSC)的45个苏云金芽孢杆菌(B t)进行了hblA、bceT及entS 3种蜡状芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因的检测.结果表明,hblA、bceT及entS的检出率分别为60%、66.7%和44.7%.这45个准菌株涉及到44个B t亚种,说明Bc肠毒素的基因在B t中是普遍存在的,B t的安全性问题仍需继续关注.

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定

目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。结果PCR扩增约770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。

基因分型技术在食物中毒调查中的溯源应用

目的:运用基因分型技术分析金黄色葡萄球菌的分子特征,为流行病学溯源提供有效手段。方法:对一起由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒进行常规鉴定后,用荧光定量PCR检测特异耐热核酸酶基因(nuc)和5种常见肠毒素基因(sea,seb,sec,sed,see),并应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分型和聚类分析。结果:23株分离菌的nuc基因检测均为阳性,其中22株检测出sea肠毒素基因,21株细菌属于同一个PFGE型别。结论:此次食物中毒由同一株金黄色葡萄球菌引起,基因分型技术可以显示食物中毒诊断证据链,为流行病学调查和溯源提供可靠依据。

PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素D基因

根据金黄色葡萄球菌肠毒素 Ｄ 基因的序列，设计相应的引物，建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素 Ｄ 基因的 Ｐ Ｃ Ｒ 技术利用该方法可从含有肠毒素 Ｄ 基因的金黄色葡萄球菌中扩增出 Ｐ Ｃ Ｒ产物扩增产物具有特异性，长为３１６ 个碱基对经限制性核酸内切酶 Ｈｈ Ｉ Ⅰ酶切证实扩增产物为 Ｓ Ｅ Ｄ 基因片段 Ｐ Ｃ Ｒ 敏感度实验显示：建立的检测金黄色葡萄球菌肠毒素 Ｄ 基因的 Ｐ Ｃ Ｒ 技术具有快速敏感简易和特异性强等特点。

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。

应用复合引物扩增大肠杆菌肠毒素基因的研究

以两对合成的不同寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、扩增肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）不耐热肠毒素（ＬＴ）和耐热肠毒素（ＳＴ）基因；两对引物从ＥＴＥＣＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ，２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交。ＬＴ扩增产物（３１４ｂｐ）和ＳＴ扩增产物（２３７ｂｐ）分别和ＳｍａⅠ和ＨｉｎｃⅡ酶切后，产生１９０ｂｐ和１２４ｂｐ，１４７ｂｐ和９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。同一扩增反应中应用ＬＴ和ＳＴ复合引物进行扩增，３种基因型ＬＴ、ＳＴ和ＬＴＳＴＥＴＥＣ从样品中鉴定出。１０９份动物腹泻粪样分别用ＰＣＲ，核酸杂交和ＥＬＩＳＡ进行测定，结果表明，ＰＣＲ是最为灵敏和快速的测定ＥＴＥＣ的方法。

北京市顺义区食源性金黄色葡萄球菌肠毒素分型方法研究

目的研究北京市顺义区食源性金黄色葡萄球菌肠毒素的分布状况,比较食物中毒和食品监测来源菌株的肠毒素型别差异。方法对顺义区2013-2014年分离的34株食源性金黄色葡萄球菌进行増菌,应用PCR方法鉴定肠毒素sea-see、seg-sej基因,同时采用ELISA方法检测肠毒素SEA-SEE。结果 34株金黄色葡萄球菌中有19株携带肠毒素,阳性率是55.9%;检出的肠毒素类型有SEA(23.5%)、SEB(29.4%)、SEC(20.6%)、SED(26.5%)、SEE(23.5%)、SEH(3.2%)、SEG(9.7%)。中毒样本与监测样本菌株的毒素检出率分别为72.7%、47.8%,但两者差异无统计学意义(χ2=1.87,P>0.05)。结论顺义区食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因携带率高,有SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEH、SEG多种类型。