HIV-1 gag和env基因片段的构建及表达

为研究人免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子生物学，发展艾滋病的诊断试剂，克隆了含HIV－1env和gag基因cDNA的质粒pUCF12。用PvuⅡ和HincⅡ降解pUCF12质粒，得到含部分p17、全部p24和全部p15基因的cDNA片段，用BglⅡ降解pUCF12质粒得到含有部分gp120和全部gp41的cDNA片段。将该两个片段分别亚克隆到表达载体PGex上，在pTac启动子的调控下，部分gag基因和env基因在大肠杆菌中表达．在SDS－PAGE中，GST＋gag融合蛋白呈现一条约70kD的染色带，其表达水平约占菌体总蛋白的18％．而GST－env蛋白则呈现一条约65kD的蛋白带，该表达蛋白约占菌体总蛋白的15％。经免疫印迹分析，该两种表达产物可分别与抗-P24和抗-gP41的单克隆抗体反应，用Abbott试剂也证明为HIV－1抗原蛋白。

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒 (Humanimmunodeficiencyvirustype 1,HIV 1)的结构蛋白 ,是HIV 1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆 ,将env基因以正确的三联密码读框插入 gag基因的下游 ,制备了HIV 1gag env嵌合基因 ,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒 p7 5启动子和牛痘病毒A型包涵体 (ATI)启动子的下游 ,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选 ,获得了 2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明 ,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV 1gag env嵌合基因。动物实验表明 ,gag env嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。

克拉玛依市HIV-1 env gag pol基因特征变异研究

目的研究克拉玛依市HIV-1 env、gag、pol基因特征及不同亚型混合感染情况。方法巢氏PCR方法扩增2017年克拉玛依市HIV新发现病例env、gag、pol基因,结合已知亚型利用Mega软件分析测序结果。结果48份样本env、gag、pol三种基因分别获得合格序列36份、35份和41份,CRF07_BC是三种基因分型的主要亚型,CRF01_AE排第二位。除此外还发现克拉玛依市存在其他亚型和重组型,HIV-1 pol基因有新型变异亚型CRF79-0107、URF-01B、URF-02B。有6份样本存在三种基因分型不完全一致情况,即不同亚型混合感染。结论克拉玛依市HIV-1防控形势相对于新疆其他地市更加严峻,预防和控制艾滋病在不同人群间相互传播、防止混合感染为目前首要任务。

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。

一株猫艾滋病病毒的巢式PCR检测及亚型鉴定

为了进一步了解猫免疫缺陷病毒(FIV)的区域流行情况,试验采用巢式PCR方法对15份流浪猫全血样品进行FIV gag基因扩增,检测出FIV阳性样品后再通过巢式PCR扩增得到FIV env基因V3~V5高变区序列,应用DNAMAN软件对阳性样品env基因的V3~V5高变区序列与NCBI中收录的参考毒株进行比对,使用MEGA 7.0软件构建进化树并进行遗传进化分析。结果表明:检测出1份FIV阳性样品,将FIV阳性株命名为XM07毒株,该毒株的env基因V3~V5高变区序列与NCBI中C78毒株的核苷酸序列相似性达到97.57%,与SH-2363毒株的核苷酸序列相似性达到96.83%;XM07毒株与SH-2363毒株在同一进化分支中,鉴定为A亚型。说明试验鉴定的FIV毒株未发生明显变异。

EIAV主要基因的分子生物学研究

马传染性贫血病毒(EIAV)属反转录病毒科慢病毒属。EIAV的RNA基因组是慢病毒基因组中最短最简单的,除了编码结构蛋白gag、pol和env外,EIAV基因组还含有三个开放阅读框架,编码慢病毒中常有的Tat和Rev蛋白及S2蛋白。EIAV最吸引人的特点在于大多数受其感染的动物最终会抑制病毒复制而形成长期的隐性持续性感染,而正是由于慢病毒复杂的分子组成机制导致与其相关的慢病毒基因组中病毒蛋白的差异表达。因此,对EIAV主要基因的分子生物学研究对于其他慢病毒疫苗的研制具有重大的意义。

EIAV基因转移载体包装盒表达质粒的构建

在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒。分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAVgag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%,编码蛋白Gag、Pol及Rev蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%。利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分别进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(westernblot),检测外源蛋白的表达情况。结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48h可检测到特异性荧光,转染后60h的细胞裂解产物中可以检测到55ku的Gag蛋白及26ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性。结果表明同时存在gag/pol和rev基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达。

钦州市钦南区HIV-1流行亚型及基因变异特征研究

目的调查流行于钦南区的HIV-1亚型种类并分析其基因变异特征。方法抽取100例未抗病毒治疗的HIV-1感染者,从血样中提取病毒RNA或前病毒DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1gag基因和pol基因片段并测序,用系统进化树分析其亚型,并计算gag和pol区的基因离散率。结果 97份血样获得gag基因序列或pol基因序列,4份血样的gag与pol分型不一致,其他93份分型明确,其中CRF01_AE重组型、CRF07_BC重组型、CRF08_BC重组型及G亚型分别占76.34%(71/93)、9.68%(9/93)、12.90%(12/93)和1.07%(1/93)。CRF08_BC的gag基因离散率为0.059±0.005,高于CRF07_BC的0.053±0.005(P<0.01)和CRF01_AE的0.049±0.004(P<0.01)。CRF01_AE的pol基因离散率为0.044±0.003,高于CRF07_BC的0.035±0.004(P<0.01)和CRF08_BC的0.033±0.003(P<0.01)。结论钦南区HIV-1存在至少3种流行亚型,其中CRF01_AE是最主要的亚型,不同基因区的变异程度有所不同。

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。

低水平病毒载量长期不进展人类免疫缺陷病毒-1感染者的人类免疫缺陷病毒-1的遗传分析

目的分析低水平病毒载量长期不进展（LTNP）HIV1感染者HIV-1的遗传特征。方法采用有限稀释套式PCR、终点PCR和序列确证分析等技术对5例低病毒载量LTNPHIV1感染者不同随访时间点H1V1前病毒enu基因c2-v3c3区域和gag基因p17区域进行扩增和序列分析，分别计算不同时间点内以及不同时间点与用于分析的最早时间点之间上述两个基因区域的基因多样性和基因离散率，依据基因离散率计算基因的进化率，统计学分析用GraphPadPrism5软件。结果5例患者在21个随访时间点共获得n5条c2-v3-c3序列和173条p17序列。进化树分析表明，不同患者的序列分开，同一患者的序列特异地聚集，序列质量可靠。5例患者env基因c2-v3-c3区域不同时间点基因多样性为0～6．38％，平均为2．1％，病例1、3和5基因多样性随感染时间的增加逐渐升高（r=0．7957、0．4954、0．3288），病例2和4基因多样性随感染时间的增加逐渐下降（r=-0．3759、-0．5028）；基因离散率为0．1％～6．5％，平均为2．9％，除病例1外，基因离散率均随感染时间间隔的增加逐渐升高，进化率分别为每年每位点-0．13％、0．81％、0．09％、0．14％和0．16％，平均为0．21％。gag基因p17区域基因多样性为0～2．5％，平均为1．2％，基因离散率为0．2％～2．7％，平均为1．4％，除病例3基因多样性和基因离散率随感染时间或时间间隔的增加下降外，其余病例均随感染时间或时间间隔的增加而逐渐升高，进化率分别为每年每位点0．087％、0．064％、-0．014％、0．081％和0．087％，平均为0．061％。结论低水平病毒载量LTNPHIV-1感染者H1V1有复制能力，病毒基因维持较低水平的进化；HIV-1-u基因变化的程度大于gag基因。

1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段分析

目的比较1例早期艾滋病病毒(HIV)感染者体内病毒不同基因片段准种复杂度。方法使用套式聚合酶链反应(Nested-PCR),扩增HIV感染者外周血淋巴细胞中病毒的gag、pol、vif-vpr和env区的部分基因,通过克隆、测序方法观察该感染者体内病毒准种分布情况,比较不同基因片段检测病毒准种的可靠性。结果不同基因片段检测病毒准种结果显示,该早期感染者体内的病毒不同基因片段显示的准种基因离散率不同,其中gag区显示出的病毒准种复杂度最高,反映为该区段病毒准种的基因离散率最高,为0·008;其他各区基因(pol、vif-vpr、env)的离散率依次为0·006、0·001、0·000。结论该HIV感染者体内病毒准种的基因中,gag区基因的突变率较高,提示Gag在机体感染HIV早期承受的免疫压力较高,因此在病毒准种研究中,gag区应该作为重要的基因区域。

夫妻感染HIV-1病毒的分子流行病学研究

目的研究宁波市HIV-1感染夫妻的免疫状况和HIV毒株的亚型分布特点和流行规律。方法收集宁波市7对已经被确认为HIV-1型阳性夫妻的全血样品,对CD4+T淋巴细胞进行绝对计数,运用巢式PCR方法扩增病毒膜蛋白env基因和gag基因区并进行序列测定。应用DNASTAR软件对序列和参考序列进行比对分析,确定基因亚型。结果成功获得11条env基因序列和13条gag基因序列,确定6株为B’亚型,2株为01_AE流行重组型,2株为07_BC流行重组型,4株为08_BC流行重组型。该11例HIV-1阳性全血的CD4+T淋巴细胞绝对数最低7个/μl,最高654个/μl,平均288个/μl。结论宁波市夫妻感染HIV-1毒株存在多种亚型,大多数的感染者免疫状况低下需要抗病毒治疗,流行形势严峻,应加强对该人群免疫状况和HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略。