HIV-1 gag和env基因片段的构建及表达

为研究人免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子生物学，发展艾滋病的诊断试剂，克隆了含HIV－1env和gag基因cDNA的质粒pUCF12。用PvuⅡ和HincⅡ降解pUCF12质粒，得到含部分p17、全部p24和全部p15基因的cDNA片段，用BglⅡ降解pUCF12质粒得到含有部分gp120和全部gp41的cDNA片段。将该两个片段分别亚克隆到表达载体PGex上，在pTac启动子的调控下，部分gag基因和env基因在大肠杆菌中表达．在SDS－PAGE中，GST＋gag融合蛋白呈现一条约70kD的染色带，其表达水平约占菌体总蛋白的18％．而GST－env蛋白则呈现一条约65kD的蛋白带，该表达蛋白约占菌体总蛋白的15％。经免疫印迹分析，该两种表达产物可分别与抗-P24和抗-gP41的单克隆抗体反应，用Abbott试剂也证明为HIV－1抗原蛋白。

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。

克拉玛依市HIV-1 env gag pol基因特征变异研究

目的研究克拉玛依市HIV-1 env、gag、pol基因特征及不同亚型混合感染情况。方法巢氏PCR方法扩增2017年克拉玛依市HIV新发现病例env、gag、pol基因,结合已知亚型利用Mega软件分析测序结果。结果48份样本env、gag、pol三种基因分别获得合格序列36份、35份和41份,CRF07_BC是三种基因分型的主要亚型,CRF01_AE排第二位。除此外还发现克拉玛依市存在其他亚型和重组型,HIV-1 pol基因有新型变异亚型CRF79-0107、URF-01B、URF-02B。有6份样本存在三种基因分型不完全一致情况,即不同亚型混合感染。结论克拉玛依市HIV-1防控形势相对于新疆其他地市更加严峻,预防和控制艾滋病在不同人群间相互传播、防止混合感染为目前首要任务。

EIAV基因转移载体包装盒表达质粒的构建

在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒。分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAVgag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%,编码蛋白Gag、Pol及Rev蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%。利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分别进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(westernblot),检测外源蛋白的表达情况。结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48h可检测到特异性荧光,转染后60h的细胞裂解产物中可以检测到55ku的Gag蛋白及26ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性。结果表明同时存在gag/pol和rev基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达。

钦州市钦南区HIV-1流行亚型及基因变异特征研究

目的调查流行于钦南区的HIV-1亚型种类并分析其基因变异特征。方法抽取100例未抗病毒治疗的HIV-1感染者,从血样中提取病毒RNA或前病毒DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增HIV-1gag基因和pol基因片段并测序,用系统进化树分析其亚型,并计算gag和pol区的基因离散率。结果 97份血样获得gag基因序列或pol基因序列,4份血样的gag与pol分型不一致,其他93份分型明确,其中CRF01_AE重组型、CRF07_BC重组型、CRF08_BC重组型及G亚型分别占76.34%(71/93)、9.68%(9/93)、12.90%(12/93)和1.07%(1/93)。CRF08_BC的gag基因离散率为0.059±0.005,高于CRF07_BC的0.053±0.005(P<0.01)和CRF01_AE的0.049±0.004(P<0.01)。CRF01_AE的pol基因离散率为0.044±0.003,高于CRF07_BC的0.035±0.004(P<0.01)和CRF08_BC的0.033±0.003(P<0.01)。结论钦南区HIV-1存在至少3种流行亚型,其中CRF01_AE是最主要的亚型,不同基因区的变异程度有所不同。

EIAV主要基因的分子生物学研究

马传染性贫血病毒(EIAV)属反转录病毒科慢病毒属。EIAV的RNA基因组是慢病毒基因组中最短最简单的,除了编码结构蛋白gag、pol和env外,EIAV基因组还含有三个开放阅读框架,编码慢病毒中常有的Tat和Rev蛋白及S2蛋白。EIAV最吸引人的特点在于大多数受其感染的动物最终会抑制病毒复制而形成长期的隐性持续性感染,而正是由于慢病毒复杂的分子组成机制导致与其相关的慢病毒基因组中病毒蛋白的差异表达。因此,对EIAV主要基因的分子生物学研究对于其他慢病毒疫苗的研制具有重大的意义。

山羊鼻内肿瘤病毒广东株的全基因测序与遗传进化分析

为了解山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的基因组特征和遗传变异情况,通过RT-PCR及序列分析方法从广东省某羊场送检病羊组织中鉴定出一株ENTV-2,将其命名为GDZJ2022。全基因组测序结果分析显示,GDZJ2022与GenBank中26株ENTV参考毒株核苷酸序列相似性为86.5%~96.9%,其中与四川ENTV-2-CHN3毒株序列同源性最高(96.9%),并处于同一分支。env核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与四川株ENTV-2-CHN1同源性最高(98.6%);gag核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与GDQY-2017同源性最高(95.2%)。

中国HIV-1B/C重组病毒的gag-pol区基因序列特征分析

目的 对 6株中国人类免疫缺陷病毒 1型 (HIV 1)B/C重组病毒的完整 gag基因和部分pol基因进行序列分析 ,从基因水平上分析是否存在新模式的B/C重组病毒并与其母本毒株进行比较研究 ,尝试对其不同的生物学表型进行解释。方法 从确诊的HIV感染者的全血样本中 ,提取样本基因组DNA ,经套式聚合酶链反应 (PCR)扩增后 ,将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析。用Simplot软件进行序列重组分析并确定重组断点区域 ;用MEGA软件按断点分段做基因进化树分析以验证该断点的正确性 ;用GCG软件包的Distance程序计算基因距离。并分析所研究的HIV 1B/C重组毒株长 2 5 5 0bp基因区段的分区段的基因离散率及基因重组对其功能可能造成的影响。结果 新疆 5份样本均未发现重组断点的变化 ,而重庆 1份样本的逆转录酶区内的B/C断点发生了 16 0个核苷酸的移动。氨基酸序列分析显示 ,我国流行的B/C重组株与其母本B、C毒株之间发生第 2 86位 (R→K/N)和第 799位 (A→T)的变化。结论 我国现在流行的HIV 1B/C重组病毒仍以CRF0 7 BC和CRF0 8 BC两种模式为主 ,在本研究涉及的基因区内尚未发现新模式重组毒株的流行。初步分析表明我国B/C重组毒株 2 86位和 799位氨基酸的变异可能为B/C重组株在我?

一株猫艾滋病病毒的巢式PCR检测及亚型鉴定

为了进一步了解猫免疫缺陷病毒(FIV)的区域流行情况,试验采用巢式PCR方法对15份流浪猫全血样品进行FIV gag基因扩增,检测出FIV阳性样品后再通过巢式PCR扩增得到FIV env基因V3~V5高变区序列,应用DNAMAN软件对阳性样品env基因的V3~V5高变区序列与NCBI中收录的参考毒株进行比对,使用MEGA 7.0软件构建进化树并进行遗传进化分析。结果表明:检测出1份FIV阳性样品,将FIV阳性株命名为XM07毒株,该毒株的env基因V3~V5高变区序列与NCBI中C78毒株的核苷酸序列相似性达到97.57%,与SH-2363毒株的核苷酸序列相似性达到96.83%;XM07毒株与SH-2363毒株在同一进化分支中,鉴定为A亚型。说明试验鉴定的FIV毒株未发生明显变异。

河北省2008年HIV-1感染者分子流行病学研究

目的利用分子生物学方法,了解2008年河北省新发现的感染者艾滋病病毒1型(HIV-1)毒株基因亚型的分布和变异情况。方法采集2008年河北省检测新发现的HIV-1感染者血样,提取血浆病毒RNA,使用套式聚合酶链反应对gag基因区和env基因区进行扩增并测定其序列。结果采集血样64份,扩增后获得序列共56份,共存在5种亚型。河北省HIV-1流行株主要为B亚型毒株,占43.1%(25/64);其次是CRF01-AE和CRF07-BC亚型毒株,各占25.9%(15/64)。结论河北省发现了5种HIV-1亚型毒株,B亚型毒株是主要的流行株,CRF01-AE亚型毒株所占比例较以往(2007年)有所下降。CRF-BC亚型毒株所占比例明显上升。可见,随着HIV-1流行时间的推移和传播途径的多样化,HIV-1流行的亚型比例也在发生变化。

中国部分地区HIV-1流行株基因型分布与母婴传播

目的 了解中国部分地区艾滋病病毒(HIV)-1主要流行区的病毒基因型分布特征及其对母婴传播的影响。方法 通过巢式聚合酶链反应对来自全国11个省(区)的HIV-1阳性病例(包括母婴病例)的gag基因和env基因的部分区域进行扩增并测序,采用DNA分析软件进行系统树和距离等分析。结果 共完成gag基因p17测序60例,env基因C2-V4区测序69例。新疆自治区和河南地区的流行株均很单一,前者为C亚型,河南省及周边地区为泰国B亚型(B'),云南地区主要为C和E亚型,而在北京和上海地区有A、B、C、E等多种不同亚型。新疆的病毒株与云南地区的C亚型极为相似,来源相似。在32对母婴病例中,主要为B和C亚型,E亚型1例,未定型2例。B亚型母亲的母婴传播率(50.0％)较明显地高于C亚型(26.7％),但差异无统计学意义。结论 中国部分地区HIV-1的亚型分布具有明显的地域特性,亚型对母婴传播的影响尚不清楚。

1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段分析

目的比较1例早期艾滋病病毒(HIV)感染者体内病毒不同基因片段准种复杂度。方法使用套式聚合酶链反应(Nested-PCR),扩增HIV感染者外周血淋巴细胞中病毒的gag、pol、vif-vpr和env区的部分基因,通过克隆、测序方法观察该感染者体内病毒准种分布情况,比较不同基因片段检测病毒准种的可靠性。结果不同基因片段检测病毒准种结果显示,该早期感染者体内的病毒不同基因片段显示的准种基因离散率不同,其中gag区显示出的病毒准种复杂度最高,反映为该区段病毒准种的基因离散率最高,为0·008;其他各区基因(pol、vif-vpr、env)的离散率依次为0·006、0·001、0·000。结论该HIV感染者体内病毒准种的基因中,gag区基因的突变率较高,提示Gag在机体感染HIV早期承受的免疫压力较高,因此在病毒准种研究中,gag区应该作为重要的基因区域。

哈尔滨市新确诊男男同性性接触者HIV-1感染者毒株基因型分析

目的分析哈尔滨市新确诊男男同性性接触者(men who have sex with men,MSM)HIV-1感染病例的毒株基因型特征。方法收集2012-2015年新确诊且未经过抗病毒治疗的HIV-1感染者抗凝血,分离外周血单核细胞,从中提取基因组DNA,采用巢式PCR法扩增gag和env基因。采用MEGA7.0软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因型特点。结果共收集148例MSM HIV-1感染者样本,均获得gag和env基因序列。系统发育树显示,其中CRF01_AE亚型108例,占73.0%;B亚型19例,占12.8%;CRF07_BC 12例,占8.1%;独特重组型9例,占6.1%。在不同年份、不同年龄群体的标本中,CRF01_AE均为优势基因型。在CRF01_AE毒株中,98.1%(106/108)与我国MSM人群参考株成簇,1.9%(2/108)与泰国及我国西南地区异性传播参考株成簇。77.8%(7/9)的独特重组型毒株来自20~40岁群体。2012年开始出现gag和env基因间重组亚型,2014年发现gag基因内重组亚型,2015年出现基因内和基因间均发生重组的复杂亚型,尚未发现env基因内重组毒株。结论哈尔滨市2012年至2015年新确诊男男同性性接触人群HIV-1感染病例中流行毒株基因型较复杂,CRF01_AE亚型毒株一直是本地区的优势毒株,同时,基因间和基因内重组毒株已出现。因此,加强MSM人群新发感染病例的实时监测,并制定有效的预防措施是非常必要的。

低水平病毒载量长期不进展人类免疫缺陷病毒-1感染者的人类免疫缺陷病毒-1的遗传分析

目的分析低水平病毒载量长期不进展（LTNP）HIV1感染者HIV-1的遗传特征。方法采用有限稀释套式PCR、终点PCR和序列确证分析等技术对5例低病毒载量LTNPHIV1感染者不同随访时间点H1V1前病毒enu基因c2-v3c3区域和gag基因p17区域进行扩增和序列分析，分别计算不同时间点内以及不同时间点与用于分析的最早时间点之间上述两个基因区域的基因多样性和基因离散率，依据基因离散率计算基因的进化率，统计学分析用GraphPadPrism5软件。结果5例患者在21个随访时间点共获得n5条c2-v3-c3序列和173条p17序列。进化树分析表明，不同患者的序列分开，同一患者的序列特异地聚集，序列质量可靠。5例患者env基因c2-v3-c3区域不同时间点基因多样性为0～6．38％，平均为2．1％，病例1、3和5基因多样性随感染时间的增加逐渐升高（r=0．7957、0．4954、0．3288），病例2和4基因多样性随感染时间的增加逐渐下降（r=-0．3759、-0．5028）；基因离散率为0．1％～6．5％，平均为2．9％，除病例1外，基因离散率均随感染时间间隔的增加逐渐升高，进化率分别为每年每位点-0．13％、0．81％、0．09％、0．14％和0．16％，平均为0．21％。gag基因p17区域基因多样性为0～2．5％，平均为1．2％，基因离散率为0．2％～2．7％，平均为1．4％，除病例3基因多样性和基因离散率随感染时间或时间间隔的增加下降外，其余病例均随感染时间或时间间隔的增加而逐渐升高，进化率分别为每年每位点0．087％、0．064％、-0．014％、0．081％和0．087％，平均为0．061％。结论低水平病毒载量LTNPHIV-1感染者H1V1有复制能力，病毒基因维持较低水平的进化；HIV-1-u基因变化的程度大于gag基因。

夫妻感染HIV-1病毒的分子流行病学研究

目的研究宁波市HIV-1感染夫妻的免疫状况和HIV毒株的亚型分布特点和流行规律。方法收集宁波市7对已经被确认为HIV-1型阳性夫妻的全血样品,对CD4+T淋巴细胞进行绝对计数,运用巢式PCR方法扩增病毒膜蛋白env基因和gag基因区并进行序列测定。应用DNASTAR软件对序列和参考序列进行比对分析,确定基因亚型。结果成功获得11条env基因序列和13条gag基因序列,确定6株为B’亚型,2株为01_AE流行重组型,2株为07_BC流行重组型,4株为08_BC流行重组型。该11例HIV-1阳性全血的CD4+T淋巴细胞绝对数最低7个/μl,最高654个/μl,平均288个/μl。结论宁波市夫妻感染HIV-1毒株存在多种亚型,大多数的感染者免疫状况低下需要抗病毒治疗,流行形势严峻,应加强对该人群免疫状况和HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略。

黑龙江省佳木斯市新确诊HIV-1感染的分子流行病学研究

目的分析黑龙江省佳木斯市新确诊的Ⅰ型人类免疫缺陷病毒感染者病例特征及病毒基因型分布,了解本地区HIV-1流行情况。方法收集57例2016-2017年新确诊HIV-1感染者资料;利用Lag Avidity EIA法判定HIV新发感染病例数;从外周血单个核细胞中提取基因组DNA,扩增gag和env基因并测序;利用Mega软件构建gag和env基因系统发育树,分析基因特点;利用HIV数据库jpHMM软件分析基因重组情况,确定重组体基因型。结果在57例感染者中,新发感染病例38例,占66.7%;通过男男同性性行为感染HIV-1的有53人,占93.0%;通过异性性接触感染HIV-1的有4人,占7.0%。病毒基因型主要分布在4个亚型内,其中CRF01_AE亚型33例,占57.9%;CRF07_BC亚型11例,占19.3%;B亚型6例,占10.5%;A1亚型2例,占3.5%。还发现5例(8.8%)独特重组型,包括2例gag基因内CRF01_AE与B亚型重组病毒,2例CRF07_BC gag和CRF01_AE env基因间重组病毒,1例CRF07_BC gag和B亚型env基因间重组病毒,均在男男同性性行为者中发现。结论男男同性性行为是佳木斯市HIV-1传播的最主要途径,CRF01_AE是本地区的优势HIV-1基因型。男男同性性行为人群已经成为佳木斯市复杂重组病毒的主要源头,实时监测该人群HIV-1新发感染病例和制定有效的防控措施是非常必要的。