Enzymatic hydrolysis of silkworm pupa and its allergenicity evaluation by animal model with different immunization routes

Silkworm pupa is a nourishing food with high nutritional value,but its consumption has been greatly limited given its allergenicity.Enzyme hydrolytic technique is recognized as an effective method to reduce the allergenicity of protein.In this study,we aimed to investigate the effect of enzymolysis on the allergenicity of silkworm pupa.Crude silkworm pupa protein was extracted through alkali extraction and acid precipitation,which included 5 proteins with the molecular weights ranging from 34 kDa to 76 kDa,and silkworm pupa were then hydrolyzed by alkaline protease.The allergenicity of silkworm pupa protein and its enzymatic hydrolysates was evaluated by establishing BALB/c mice model,and the mice were immunized via intragastric gavage and intraperitoneal injection,respectively.The results indicated that the intraperitoneal inj ection immunization route induced more by detecting with antibodies,histamine and Th2-related cytokines.Moreover,mice treated with silkworm pupa protein peptide displayed no obvious allergic symptoms,indicating that enzyme hydrolytic technique could significantly reduce the allergenicity of silkworm pupa.

酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽的分离与稳定性研究

目的:研究酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽的分离和稳定性,为其开发应用提供基础数据。方法:超滤分离酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽,比色法测定其抗氧化能力。结果:超滤分级后得到分子质量为200～3 000 D的酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽对O2-?、?OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的IC50分别为18.85 mg/mL、3.13 mg/mL、35.23 μg/mL。该抗氧化肽经过4 h胃蛋白酶+胰蛋白酶处理前后对DPPH自由基清除率分别为81.05%、82.26%;在pH 4、8条件下处理1 h,对DPPH自由基清除率分别为98.02%、11.80%(100 μg/mL);在温度95 ℃条件下处理1 h,对DPPH自由基清除率为87.11%(100 μg/mL);用浓度为1.0 mol/L的NaCl处理6 h,相比对照组,对DPPH自由基清除率由51.58%下降到22.68%(60 μg/mL)。结论:超滤后得到的分子质量为200～3 000 D的酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽的抗氧化能力比酶解原液有一定提高;且在酸性、高温、脱盐处理后对DPPH自由基的清除能力保持较好;胃肠道消化酶对其DPPH自由基清除能力的影响不显著(P>0.05)。

蚕蛹蛋白酶解产物体外抗氧化和降血压活性筛选及响应面工艺优化

以蚕蛹蛋白为原料,使用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶对其进行酶解,采用1,1-一苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)法、超氧阴离子自由基(O-2.)法、羟自由基(.OH)法和血压紧张素转化酶(ACE)法对酶解产物进行抗氧化和降血压活性分析,筛选同时具有较强抗氧化和降血压活性的酶解产物,并确定获得较强活性时的水解度,再通过响应面对该水解度下酶解工艺条件进行优化。结果表明:碱性蛋白酶在水解度为20%左右时获得的水解产物抗氧化和降血压效果较好,并由响应面分析结果表明酶解温度和加酶量之间存在显著的交互作用,同时得到最佳酶解工艺条件为:酶解温度51℃,pH值为9.05,加酶量为0.38%,酶解时间3h,在此条件下,水解度为20.53%,再通过实验验证其误差值小于5%,说明采用响应面试验设计方法对蚕蛹蛋白酶解体系进行优化具有较好的可靠性。此时酶解产物的DPPH自由基抑制率为51.2%,ACE抑制活性为50.3%。

蚕蛹多肽的制备工艺及其体外抗氧化活性

采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解蚕蛹蛋白,以水解度和清除DPPH·能力为指标对酶解过程进行分析,并研究水解产物多肽的体外抗氧化活性。结果表明,碱性蛋白酶对蚕蛹蛋白具有较好的水解效果,其水解产物有较高抗氧化活性,对DPPH·、超氧阴离子自由基(O2·)和羟自由基(·OH)都具有较强的清除能力。-

酶法水解蚕蛹蛋白制备免疫活性肽工艺的研究

利用复合酶水解蚕蛹蛋白制备小分子多肽,通过正交实验得到水解工艺的优化组合为:木-Fla复合酶,酶用量为0.5%,底物含量为4%(1∶25),酶解pH为7.0,反应温度为60℃,酶解时间为3h,在此条件下水解,小分子多肽得率为32.16%,同时建立了毛细管凝胶电泳测定蚕蛹多肽分子的检测方法。碳粒廓清实验表明:蚕蛹蛋白酶水解液中小分子多肽可增强小鼠网状内皮系统吞噬功能。

酶法水解蚕蛹蛋白制备多肽的工艺研究

研究了几种蛋白酶对桑蚕蛹蛋白粉的水解情况 ,采用均匀设计法对桑蚕蛹蛋白粉的限制水解条件进行了优化选择 ,得到胰酶水解桑蚕蛹蛋白粉的优化条件为 :酶用量占底物的质量分数为 4 50 % ,底物含量的质量体积分数为 1 5% ,反应温度为 4 0℃ ,水解时间为 6 0h ,水解pH值为 8 0 ,在此条件下水解 ,酸溶性肽得率可达 92 3 7% .

蚕蛹蛋白酶法水解及美拉德反应改良其产物风味的研究

对多种蛋白酶的酶解效果进行比较,确定了制备酶解脱脂蚕蛹粉短肽和氨基酸的最佳条件,最终确定Alcalase 2.4L和风味蛋白酶的组合为最优方案,酶解液氨基氮含量达到43.17mg/g,总肽氮含量为47.13mg/g,蛋白回收率67.72%,酶解液感官评价值最高。在同等的美拉德反应条件下,Alcalase 2.4L和风味蛋白酶复合酶解的酶解液的香气最为浓郁,腥味被掩盖。

响应曲面法优化动物蛋白酶水解脱脂蚕蛹蛋白的工艺

采用响应曲面法对动物蛋白酶水解脱脂蚕蛹蛋白的工艺进行优化。在单因素考察的基础上,选定温度、pH值、加酶量、液料比为试验因素,蚕蛹蛋白水解度为考察指标,分析结果表明,温度和加酶量的线性效应、温度和pH值及液料比的平方效应、温度和pH值的交互效应对蚕蛹蛋白水解度的影响达到极其显著水平。动物蛋白酶水解脱脂蚕蛹蛋白的最佳工艺为温度45℃、pH7.56、加酶量4.24%、液料比29.7、水解8h,在此条件下水解度为48.24%。

基于响应面法的蚕蛹蛋白降血脂肽的酶解条件优化

基于响应面法对中性蛋白酶降解蚕蛹蛋白制备降血脂肽的酶解条件进行了优化。得到制备蚕蛹蛋白降血脂肽的最佳酶解条件为:酶量5.1%(w/w),酶解时间5h,酶解温度52℃,酶解pH=7.0,底/水比(w/v)=3.9%。在此条件下,蚕蛹蛋白降血脂肽对3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)的抑制率为45.24%。建立了基于蚕蛹蛋白降血脂肽酶解条件的优化模型。验证实验结果表明该模型的预测准确率达97.31%。

酶解蚕蛹蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的工艺优化

采用碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白,制备血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制肽,是蚕蛹蛋白深度开发的途径之一。以ACE抑制率为响应值,用响应面分析法研究酶解温度、酶解pH和加酶量等因素对酶解产物的ACE抑制活性的影响,优化制备工艺。结果表明,各因素对制备ACE抑制肽的活性影响程度由大到小依次为酶解pH、酶解温度、加酶量。获得碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为:酶解温度50.8℃,酶解pH 9.0,加酶量3 500 U/g。在此条件下,蚕蛹蛋白酶解产物对ACE的理论抑制率最高可达96.67%,验证值为96.49%±1.75%,IC50值为0.102 mg/mL,预测模型可靠性高,可应用于蚕蛹ACE抑制肽的酶法制备。

蚕蛹蛋白酶解制备抗氧化肽的初步研究

将蚕蛹通过粉碎和丙酮脱脂后,得到蚕蛹蛋白粉。用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解蚕蛹蛋白粉,以DPPH清除能力为指标对酶解过程进行分析,结果表明胃蛋白酶对蚕蛹蛋白有较好的酶解效果。然后通过正交优化胃蛋白酶的酶解条件,并研究水解产物多肽的体外抗氧化活性。

超声波预处理蚕蛹蛋白的酶解动力学研究

为了预测和控制用超声波辅助酶解蚕蛹蛋白过程中的蛋白质酶解程度,应用数学推导方法并结合酶解试验对超声波处理前后蚕蛹蛋白的酶解动力学进行研究。首先分析了初始底物浓度和蛋白酶浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响,表明超声波预处理和未处理的蚕蛹蛋白水解度均随着水解蛋白酶Alcalase初始浓度的增加而增大,随着初始底物浓度的增加而减小。基于蚕蛹蛋白水解度与酶解时间的关系构建的酶解动力学模型显示:超声波预处理改变了蚕蛹蛋白的酶解动力学参数,提高了蚕蛹蛋白酶解反应的最大临界初始底物浓度。验证试验表明建立的酶解动力学模型与实际酶解过程基本吻合,确证经超声波预处理后蚕蛹蛋白更易被Alcalase酶酶解。

蚕蛹蛋白中性蛋白酶可控水解动力学模型

提出了同时考虑产物抑制、底物抑制、酶失活等因素的机理模型,并应用到蚕蛹蛋白中性蛋白酶水解体系中,证明了在该体系中底物抑制现象的存在,并推导出相关动力学和热力学常数分别为Km=4.02g.L-1,k2=130.9min-1,Ks=110.4g.L-1,kd=24.6min-1,C0=1.38×10-4,rmax=15.4g.L-1.min-1和Ea=44.5kJ.mol-1,并通过实验结果比较验证模型的可靠性,结果表明计算值与实验值较为吻合,相对误差只有3.80%,说明该模型具有较好的推算性。

微细化-蛋白酶解对蚕蛹蛋白营养价值和功能特性的影响

本实验采用磨球超微粉碎-蛋白酶解的方法改性处理蚕蛹蛋白,研究了改性处理后蚕蛹蛋白的营养价值和功能特性。结果表明:微细化-酶解改性处理后蚕蛹蛋白的必需氨基酸/非必需氨基酸、必需氨基酸/总氨基酸均达到联合国粮食及农业组织和世界卫生组织推荐模式标准,营养价值显著提升(P<0.05);改性处理后蚕蛹蛋白的水解度提高了65.62%,溶解度、乳化性和起泡性分别提高了402%、187%和141%;巯基含量增加了57%,二硫键含量降低了21%;二级结构无规卷曲含量由37.46%增加到91.33%;剂量为25μg/m L的蚕蛹蛋白改性处理后,促小鼠脾细胞增殖能力增加了100%,免疫能力极显著提高(P<0.01)。

中性条件下2种酶解方法提取蚕蛹蛋白的比较研究

为了寻求经济实用的酶解蚕蛹蛋白的方法,本研究以新鲜和烘干蚕蛹为原料,在中性条件下比较了中性蛋白酶和风味蛋白酶对蚕蛹的水解程度及蛋白收率。结果表明:在中性条件下2种蛋白酶作用后鲜蛹水解蛋白液的蛋白收率和水解度高于干蛹水解蛋白液。风味蛋白酶水解后的蛋白收率高于中性蛋白酶,但水解度小于中性蛋白酶,造成这样的原因可能是由于风味蛋白酶的内切酶活性较低。因此,在实际应用中可尽量采用新鲜蚕蛹为原料,并根据蛋白水解产物不同的需求采用不同的蛋白酶进行处理。

家蚕蛹蛋白酶解产物对肿瘤细胞MGC-803的增殖抑制活性鉴定

以不同蛋白酶酶解制备家蚕蛹蛋白酶解产物（SPPHs）,采用MTT比色法检测其对人胃腺癌细胞MGC-803的增殖抑制活性。不同蛋白酶酶解制备SPPHs对MGC-803的增殖抑制作用存在显著差异（P〈0.05）,其中家蚕蛹蛋白以Alcalase 2.4L酶解的产物（AH）对MGC-803的增殖抑制活性最高,当AH的质量浓度为0.25 mg/m L时,水解度（DH）=25%的AH的抑制活性最高,对MGC-803细胞的增殖抑制率可达到92.74%。Alcalase2.4L酶解家蚕蛹蛋白产物的分子质量也显著影响其对MGC-803细胞的增殖抑制活性,其中分子质量〈5 k D组分的抑制率高达91.13%,将该组分经葡聚糖（G-25）凝胶层析后分离出4个组分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）,组分Ⅱ对MGC-803细胞的增殖抑制率最高（27.5%）,但与未分离样品相比,抑制效率显著降低,而其他3个分离组分则无抑制作用。研究结果提示,蚕蛹蛋白酶解产物对肿瘤细胞的体外增殖有抑制作用,并且这种抑制作用可能是由多种组分协同完成。

酶解脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽

以实验室自制的脱脂蚕蛹蛋白为原料,利用酶工程技术,通过对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶等的筛选及单因素和响应面优化试验,对ACE抑制肽的制备工艺条件进行较系统的研究。结果表明:选择碱性蛋白酶作为脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的酶,制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为料液比11.88:100、温度50.22℃、pH 9.46、加酶量7.03%、酶解4h。在此条件下制备的ACE抑制肽的ACE抑制率达到41.98%。

蚕蛹蛋白酶解肽对断奶仔猪血液生化指标和小肠黏膜的影响

选择21日龄断奶的杜大长仔猪64头,随机分为2组,每组4个重复,每个重复8头仔猪。对照组饲喂基础日粮,试验组添加0.3%蚕蛹蛋白酶解肽。试验结果表明:⑴蚕蛹蛋白酶解肽明显提高断好仔猪日增重,降低料重比和腹泻率。⑵断奶后14 d,试验组血清碱性磷酸酶和血清铁明显高于对照组。⑶添加蚕蛹蛋白酶解肽可显著提高断奶后14 d仔猪十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度,降低十二指肠、空肠和回肠的隐窝深度。⑷添加蚕蛹蛋白酶解肽可显著提高断奶后14 d仔猪空肠黏膜蔗糖酶和麦芽糖酶活性。

蚕蛹蛋白质的酶—酸两步水解

将木瓜蛋白酶催化水解和酸水解联合起来应用于水解蚕蛹蛋白质制备氨基酸。与单纯酶解(水解时间48h)或酸水解(水解时间24h)相比,水解时间分别缩短了2/3和1/3,后处理简化,能耗降低。研究了蚕蛹蛋白质水解的影响因素,在适宜条件下,得到有香味的混合氨基酸,收率为98.5％(对蛋白质),其中含有17种游离氨基酸(色氨酸未测),含量为47.9％。

采用酶解法提取蚕蛹油脂的工艺条件优化

以缫丝蚕蛹为原料,用酶解方法提取蚕蛹中的油脂,建立环保、高效的蚕蛹油脂提取工艺技术。在单因素试验分析酶解温度、pH、胰蛋白酶用量、提取时间对蚕蛹油脂提取率的影响基础上,采用正交试验优化酶解工艺条件为:酶解温度50℃,酶解体系pH 8.5,2 500 U/mg胰蛋白酶用量为2%(相对于蛹粉的质量分数),酶解提取时间4 h。在优化的酶解工艺条件下蚕蛹油脂提取率可达23.55%,占蚕蛹粗脂肪总含量的77.04%,优化的酶解工艺条件具有实用价值。