婴儿配方乳粉中食源性致病菌双重ERA快速检测方法的建立

为快速多重筛查婴儿配方乳粉中食源性致病菌的污染情况,建立克罗诺杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌双重酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)快速检测方法。首先,通过筛选确定对4种食源性致病菌特异性好、扩增效率高的引物探针。经过优化建立两组双重ERA检测体系可快速筛查4种食源性致病菌。该方法对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌的检出限均为10^(-2) ng/μL;对克罗诺杆菌的检出限为1 ng/μL。模拟污染实验显示,污染量为1 CFU/mL的样品增菌培养6 h后,可检出4种致病菌。应用该方法对市售婴儿配方乳粉样品进行检测,检测结果与行业标准规定的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法一致,证实了本研究建立的双重ERA检测方法的准确性和可靠性。采用本方法仅需20 min左右即可一次性检出4种致病菌,相较于传统的“金标准”方法以及实时荧光PCR法显著提高了检测效率,对于推进食源性致病菌的快速筛查具有重要意义。

沙门氏菌ERA可视化快速检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的快速检测,选用文献报道的沙门氏菌RPA引物和探针,建立酶促等温扩增(ERA)荧光法和显色法两种沙门氏菌可视化快速检测方法,并分析两种方法的特异性、灵敏度、检出限等指标。同时,为满足实验室外现场检测环境的要求,分别采用自热包和热帖作为现场DNA提取和ERA反应的热源,建立不依赖实验室设备的方法。优化后两种ERA方法检测时间分别为11 min和4 min,灵敏度均可达10^(-2) ng/μL,人工污染样品增菌培养4 h后检出限为1 CFU/mL。本研究创新性地将沙门氏菌RPA引物探针应用到ERA检测体系,建立了荧光法和显色法两种可视化快速检测方法,并集成现场DNA提取和ERA反应检测套组,提高了扩增效率,摆脱了对传统实验室设备的依赖,对于推进食源性致病菌现场可视化快速检测具有重要意义。

GI和GII诺如病毒ERA的可视化快速检测

诺如病毒(NoV)是常见的食源性病毒之一,只要极少数量的NoV就可以导致机体感染发病,但目前还没有特效的治疗药物和疫苗,因此建立快速检测方法对食品中的NoV进行早期筛查至关重要。本研究首先通过装甲RNA技术将GB 4789.42规定的GI和GII NoV的靶标基因包裹到MS2噬菌体的衣壳蛋白中,制成内含GI和GII NoV两联检测靶标的重组质粒参考样品,其次基于酶促等温扩增(ERA)技术,分别设计了GI和GII NoV基础型ERA和荧光型ERA检测的引物和探针,并通过试验筛选确定了最佳的引物探针组合。从而建立了GI和GII NoV检测ERA显色法和荧光法两种可视化方法,通过肉眼可直接观测结果。进一步对反应程序进行了优化,将ERA显色法和荧光法的扩增时间分别缩短至5min和8min。并通过对反应体系的优化,将体系减半,从而降低了检测成本。在此情况下,对核酸参考样品检测的最低灵敏度分别可达10^(-2)、10^(-3)ng/μL。最后将本研究建立的可视化快速检测方法应用于真实的GI和GIINoV粪便样本检测,并对方法的性能参数进行分析,结果显示:建立的GI和GII NoV ERA可视化快速检测方法特异性良好,对其他食源性病毒无交叉扩增,最低可检出10拷贝/μL的NoV,可以满足GI和GII NoV可视化快速筛查的需求。本研究方法的建立为NoV的快速筛查和风险监测提供了良好的技术支撑,对于控制NoV爆发、保障人民健康具有重要意义。

双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。

基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD的犀牛特异性检测技术

野生犀牛(Rhinocerotidae)种群的生存正面临极大威胁,包括栖息地减少、碎片化及偷猎等,在对打击犀牛角等非法贸易的努力中,物种的特异性检测至关重要,为了在现场就可以迅速完成犀牛源性成分鉴定,将酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)、CRISPR/Cas12a和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术相结合,研发了一种适于现场使用的犀牛特异性核酸检测方法。结果表明:该方法只能检测出5种现生犀牛特异性核酸,与其他哺乳动物核酸测试样本没有交叉反应,最低检测下限可达100拷贝/孔,具有较好的特异性和灵敏度。该方法可以在36.5~40.0℃条件下,27~30 min完成特异性识别,无需高规格的实验室环境和精密仪器,从而提供更快、更准确和更灵敏的检测方案。

ERA实时荧光法快速检测鹦鹉热衣原体方法的建立

目的建立一种快速检测鹦鹉热衣原体(Cps)的酶促重组等温扩增(ERA)实时荧光法。方法根据鹦鹉热衣原体MOMP基因序列设计特异性引物和探针,建立ERA实时荧光法反应体系。优化体系中的引物和反应温度,再评价ERA实时荧光法的敏感性和特异性,以及对39例鸟类肺组织样本进行验证。结果ERA实时荧光法可在40℃恒温条件下15 min内特异性扩增鹦鹉热衣原体,其检出限为10 copies/μL,特异性好。ERA实时荧光法检出39例鸟类肺组织样本中阳性样本30例,阴性样本9例,其灵敏度为96.77%,特异度为100.00%,阴性预测值为88.89%,阳性预测值为100.00%。结论成功建立用于鹦鹉热衣原体检测的ERA实时荧光法,其操作简单,且灵敏度和特异度好。

基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

基于B646L、EP402R、MGF360/505基因的非洲猪瘟病毒ERA检测方法的建立

【目的】建立一种基于酶促重组酶扩增(Enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)DNA快速检测方法。【方法】参考ASFV B646L基因、EP402R基因和多基因家族成员MGF360/505基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立42℃等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。【结果】ERA-ASFV-B646L、ERA-ASFV-EP402R和ERA-ASFV-MGF3个检测方法分别在16、7和13 min内即可得出检测结果;特异性强,对阳性样品拷贝数的检测下限均为102μL-1;与我国非洲猪瘟诊断技术标准中的方法对比,结果符合率为100%。【结论】本研究建立的ERA检测方法可以用于ASFV的快速检测,为流行病学调查和现场检测提供了一种快速有效的检测方法。

重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展

随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术。这3种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。

重组酶扩增技术概述及应用研究进展

重组酶扩增技术是近几年快速发展起来的一类等温扩增技术,相对于传统的核酸检测方法,具有设备要求低、操作简单等优势,在现场快速检测方面有着广阔的应用前景。本文简要介绍了重组酶扩增技术的技术原理、优点和难点,重点阐述了其在病毒、细菌、寄生虫及其他微生物检测领域的应用研究进展,旨在为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。

Filtration assisted pretreatment for rapid enrichment and accurate detection of Salmonella in vegetables

Rapid detection of target foodborne pathogens plays more and more significant roles in food safety,which requires the efficiency,sensitivity,and accuracy.In this research,we proposed a new st rategy of isothermal-molecular-amplification integrated with lateral-flow-strip for rapid detection of Salmonella without traditional enrichment-culture.Th e designed syringe-assisted-filtration can contribute to simultaneous collection and concentration of target bacterium from vegetable samples in just 3 min,resolving the drawbacks of traditional random sampling protocols.After simple and convenient ultrasonication,samples can be directly amplified at 39℃ in 25 min and the amplicons are qualitatively and quantitatively analyzed with the designed lateral-flow-strip in 5 min.Finally,satisfied results have been achieved within 40 min,which greatly improve the efficiency while the accuracy is also guaranteed.Furthermore,all detection steps can be completed under instrument-free conditions.This method will hold great promise for target pathogen detection in the resource-limited district,or for emergency on-site identification.

ERA实时荧光法快速检测乙肝病毒的建立与应用

基于酶促重组等温扩增(ERA)技术构建一种快速检测乙肝病毒的实时荧光检测方法。根据乙肝病毒聚合酶编码区(P区)保守序列设计引物和探针,对引物、温度、荧光探针浓度等反应条件进行优化,建立ERA实时荧光法最佳反应体系,再对其敏感性、特异性、抗干扰能力、临床样本检出效果进行验证。结果显示:ERA实时荧光法在42℃、20 min内可完成对乙肝病毒的检测,最低检出限为102 copies/μL;除乙肝病毒外,其他4种病毒(甲肝病毒、丙肝病毒、EB病毒、巨细胞病毒)均未产生荧光扩增曲线,具有良好的特异性和抗干扰能力;以实时荧光PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法检测58份乙肝病毒临床样本的灵敏度为97.37%、特异度为100%、阴性预测值为95.24%、阳性预测值为100%、Kappa值为0.96。成功建立了一种简单、快速、灵敏、特异、低成本的乙肝病毒早期检测方法,满足乙肝病毒快速检测的需要。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。

基于酶促恒温扩增技术快速鉴别天麻真伪检测方法的建立与应用

目的:基于酶促恒温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术建立一种可快速定性鉴别道地药材天麻真伪的方法。方法:遵循ERA引物设计原则,应用Oligo 7.0软件根据天麻及其常见伪品的ITS2基因组序列,筛选优化天麻ERA特异性引物,应用Primer Premier 5.0软件设计天麻特异性PCR鉴别引物,通过对ERA、PCR反应体系的优化,最终确定ERA最佳反应时间为17 min,最适反应温度为40℃;PCR最优退火温度为57℃,循环为32次,对所建立的方法进行灵敏度、特异性验证,并选取中药市场市售天麻样品进行检测。结果:所设计的天麻ERA鉴别引物与其常见伪品间无交叉反应,特异性良好;重复性结果显示,3次重复性检测结果一致,未出现假阳性与假阴性;该方法对天麻基因组DNA的灵敏度为1 pg·μL^(-1),比传统PCR灵敏性高;ERA技术能够用于天麻市售样品的快速鉴定,且检测结果与PCR方法相同。结论:所建立的检测方法操作简单、快速,具有较高的特异性和灵敏度,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了一种新手段。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测基孔肯雅病毒方法的建立

目的建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)的基因检测技术方法.方法以CHIKV非结构蛋白1(non-structural protein 1,NSP1)基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性.结果在40℃恒温条件下,利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增,该方法最低检出限可达10拷贝/μL,且当CHIKV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性.结论成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法,该方法操作简便、检测限低且特异性好.

酶促重组酶扩增-侧流层析快速检测沙门菌的方法研究

目的建立一种酶促重组酶扩增(ERA)和侧流层析技术(LF)相结合的沙门菌快速检测方法,为沙门菌现场检测提供技术支持。方法根据沙门菌属高度保守的鞭毛基因fimY设计特异性ERA引物,采用毛细管电泳筛选合适的引物,再设计探针,对扩增温度和时间进行优化,建立ERA-LF检测体系对菌株DNA进行扩增,采用侧向流试纸条检测产物。采用鼠伤寒沙门菌标准菌株检验方法的灵敏度,采用10种其他肠道感染标准菌株检验特异度,采用实际分离到的沙门菌验证对实际样本检测能力。结果经过毛细管电泳筛选获得沙门菌特异性引物,在扩增温度为37℃、反应时间为20 min的条件下,最低检测浓度为5 copies/μL。本方法对沙门菌核酸扩增结果为阳性,10株其他肠道感染菌核酸扩增结果均为阴性,特异度较好。对100株(包含10种血清型)沙门菌进行检测,结果均显示阳性。结论本研究建立的ERA-LF方法可用于沙门菌的现场即时检测。

基于逆转录-酶促重组等温扩增原理的西尼罗病毒基因检测方法的建立

目的建立一种可用于检测西尼罗病毒特异性基因片段的逆转录-酶促重组等温扩增(RT-ERA)方法。方法以西尼罗病毒NS5基因的高度保守序列作为靶序列,根据ERA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立荧光RT-ERA反应体系。分别以不同拷贝数(10^(4)、10^(3)、10^(2)、10、1拷贝/μl)的含120 bp靶基因片段的重组质粒及不同浓度(10、1、10^(-1)、10^(-2)、10^(-3)ng/μl)西尼罗病毒RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的敏感度;分别以森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒、Ⅰ型登革病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒和甲型流感病毒H2N1的RNA为模板进行荧光RT-ERA法检测,评价该方法的特异性。结果建立的荧光RT-ERA法可在39℃、20 min内特异性扩增西尼罗病毒RNA。敏感度检测结果显示,以重组质粒为模板,荧光RT-ERA法最低可检出的质粒拷贝数为1拷贝/μl;以RNA为模板,荧光RT-ERA法最低可检测浓度为10^(-3)ng/μl。特异性检测结果显示,以森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒I型、乙型脑炎病毒、黄热病毒和甲型流感病毒H2N1的RNA为模板,荧光RT-ERA法检测结果均为阴性,仅西尼罗病毒RNA扩增阳性。结论成功建立了一种可用于检测西尼罗病毒RNA的荧光RT-ERA法,该方法操作简便,敏感度和特异性均较好。

酶促恒温扩增技术快速鉴定食品中牡蛎成分

目的:针对牡蛎建立基于酶促恒温扩增(Enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的快速检测方法。方法:基于NCBI上牡蛎线粒体的基因保守序列,通过Primer Premier 5.0软件设计5对ERA特异检测引物,并筛选出最佳引物。优化ERA反应的模板浓度、引物浓度、扩增温度和时间,最终获得最佳的反应体系,并进行灵敏度和特异性的验证,同时分别选取市场上几种牡蛎及其相关产品进行样本验证。结果:最终得出最佳ERA反应温度为39℃,最佳反应时间为20 min,优化后反应体系检测出牡蛎相关食品中的牡蛎成分灵敏度可达800 fg/μL,且特异性良好。结论:建立的检测方法具有操作简单、快速、不依赖于高端设备的优势,较高的特异性和灵敏度,为食品中牡蛎成分的快速、恒温、现场鉴定提供了一种新手段。