仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。

以羊膜为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞并形成单层组织 ,为以后内皮细胞层移植提供方法和材料来源。方法 胰酶消化去除羊膜上皮细胞 ,保留基底膜作为载体 ,种植兔角膜内皮细胞 ,体外培养形成单层内皮层 ,并进行形态、组织学、超微结构观察。结果 角膜内皮细胞在羊膜上黏附生长并增殖 ,体外培养 6～ 7d即融合成单层 ,其形态及生长密度优于单纯培养皿上培养的内皮细胞。复合角膜内皮组织由羊膜基底膜和单层扁平内皮细胞组成 ,与生理状态下的角膜内皮组织相近。结论 以羊膜为载体培养角膜内皮细胞可形成单层细胞层 。

以异种后弹力膜基质为载体培养角膜内皮细胞的研究

目的 探讨以异种后弹力膜 (DM) /基质为载体培养角膜内皮细胞的可行性 ,为培养内皮细胞的临床移植提供新的方法和供体材料。方法 取厚 10 0 μm的猪角膜后层 ,冻存解冻后置中性蛋白酶 3 7℃孵育 5min ,去除内皮细胞 ,保留DM及薄层基质 ,置纯甘油中脱水保存 6个月 ;使用前复水 ,紫外线二面灭菌 ,制备成载体 ;接种兔角膜内皮细胞于载体的DM面并体外培养 ,行细胞形态、密度、组织学、超微结构的观察。结果 兔内皮细胞在猪DM/基质载体上贴附生长 ,形成紧密连接的单层 ,形态近似六角形分布 ;细胞密度达 ( 3 62 0± 110 2 3 )个 /mm2 ,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论 角膜内皮细胞能够在异种DM/基质载体上良好生长 。

孔源性视网膜脱离患者视网膜表面膜组织的体外培养

目的 建立体外培养增生性玻璃体视网膜病变(PVR)患者病变膜组织的方法,为提供PVR研究奠定基础。方法 孔源性视网膜脱离伴有PVR分级D级患者进行玻璃体切割术同时获取其视网膜表面膜病变(ERM)标本,患者病程7－120天;ERM膜片应用切块贴皿法进行接种,培养皿短时间斜置使ERM组织贴壁,每3－4天换培养液1次,观察记录膜组织中细胞的迁出、分裂和增生状况,部分病变标本进行免疫细胞化学鉴定。结果7例患者的ERM组织提供体外原代培养,培养期间膜片色素变淡,其中3例患者的膜组织有细胞从膜片边缘向外迁移,生长缓慢,迁出的细胞呈现两种形态:铺路石样和梭形。cytokeratin染色呈阳性。结论 患者ERM体外培养方法可行,细胞生长情况与多因素有关。ERM中的细胞主要是RPE细胞,其增殖能力有可能评估手术预后。

中空纤维生物反应器的构建及其体外灌流实验

设计原代培养的乳猪肝细胞构建生物反应器,并观察肝细胞生长特点,进行体外灌流实验。采用改良的原位胶原酶灌流法分离乳猪肝细胞及间质细胞,在中空纤维舱的纤维外间隙中共培养,并间断旋转抑制细胞贴壁。用该生物反应器建立人工肝系统,对肝硬化病人的腹水进行体外灌流实验。结果表明,乳猪原代肝细胞平均产量为(6.29±0.37)×108细胞,肝细胞的活性为84%;在纤维外间隙内间断转动培养3 h后肝细胞聚合成球。电镜可见,多个肝细胞聚合成团生长,培养的肝细胞有功能性结合,并向组织型转化。测定中空纤维舱内连续48 h培养液尿素浓度,证实肝细胞聚合体有很好的尿素合成功能。体外灌流后,生物反应器组腹水总胆红素下降,A ST升高,与对照组相比有显著性差异。生物反应器组葡萄糖浓度下降,对照组无显著变化,两组间有显著性差异。通过本组实验,证实了我们设计的生物反应器所构成的生物型人工肝(BAL)是有效的。

烟草中央细胞体内与离体发育中的细胞化学变化

应用金霉素（ＣＴＣ）、ｆｌｕｐｈｅｎａｚｉｎｅ（ＦＰＺ）、荧光增白剂（ＣＷ）、ＤＡＰＩ等荧光探针，标记由大叶烟草体内直接分离和经过离体培养的中央细胞及卵器细胞，观察膜结合钙及钙调素的分布与细胞壁和细胞核的动态。用碘－碘化钾、苏丹Ⅲ等染色鉴定中央细胞与胚乳细胞内的淀粉与油脂。探讨了中央细胞等在受精前后与培养前后的细胞化学变化。

羊膜对山羊角膜缘上皮细胞培养影响的研究

比较完整羊膜和去上皮羊膜、不同冻存时间的羊膜对山羊角膜缘上皮细胞体外培养的影响,筛选出羊膜最适处理方法。将山羊角膜缘组织块分别接种于完整羊膜、去上皮羊膜、新鲜去上皮羊膜、冻存30d去上皮羊膜、冻存90d去上皮羊膜、冻存180d去上皮羊膜上,比较在完整羊膜和去上皮羊膜及不同冻存时间羊膜上角膜缘上皮细胞的生长特性和组织结构。试验结果显示,在去上皮羊膜上角膜缘组织块贴壁和细胞增殖能力较完整羊膜强,角膜缘上皮细胞在2组羊膜上均能形成多层结构,但完整羊膜上形成的组织表层角质化较严重;在冻存30d羊膜上角膜缘组织块贴壁和细胞增殖能力较新鲜羊膜、冻存90d羊膜、冻存180d羊膜强,角膜缘上皮细胞在各组羊膜上均形成多层结构,其结构无明显差异。结果表明,冻存30d去上皮羊膜是构建组织工程人工角膜最适的羊膜载体材料。

成年兔雪旺细胞与医用组织引导再生胶原膜联合培养后植入体内的实验研究

目的 :探索用组织工程方法构建人工神经的可行性。方法 :应用医用组织引导再生胶原膜作为支架与成年兔雪旺细胞培养 2周 ,以雪旺细胞胶原膜复合物的形式修复自体神经缺损。 8周后对所获得的组织工程神经移植物进行形态学研究。结果 :成年兔雪旺细胞在医用组织引导再生胶原膜上生长良好并均匀分布于支架表面 ,形成bungner带 ,且基质分泌旺盛。神经已通过移植物长入远端 ,胶原膜已吸收。结论 :雪旺细胞可以在医用组织引导再生胶原膜上得到扩增 ,形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性 ,本研究为组织工程方法修复长段神经缺损打下基础。

增殖性玻璃体视网膜病变视网膜前膜体外培养及免疫组化鉴定

目的探讨视网膜前膜组织培养中存在的细胞迁出率低、传代困难等问题；观察培养细胞的成分及体外培养细胞迁出率和增殖力与PVR发病时间的相关性。方法使用组织块培养法对手术中剥离的PVR患者视网膜前膜组织进行体外培养；双目倒置显微镜下观察细胞生长状况；DAB显色法对细胞进行免疫组化鉴定。结果PVR在3个月内的细胞迁出率与3个月以上的细胞迁出率和细胞传代率都有统计学意义；共培养31例前膜组织其中23例有细胞迁出，14例成功进行了细胞传代，8例传至第四代；免疫组化鉴定见：s-100、CK为阳性，Vimt、GFAP仅少部分细胞呈阳性，CD34呈阴性反应。结论PVR3个月内的患者的视网膜前膜组织是进行视网膜前膜组织体外培养的最佳选材；培养的细胞视网膜色素上皮细胞为主，含有少部分成纤维细胞及神经胶质细胞。

PLGA生物膜和延长的神经轴突束构建人工神经的体外研究

目的探索新的构建人工神经的方法,寻找合适的支持周围神经移植的基质材料。方法将鼠胚皮质神经元细胞种在PLGA生物膜支架上,用自制的神经轴突延长装置对其延长。观察神经元细胞及轴突生长情况,测定轴突延长后轴膜的渗透性。同时用免疫组化方法对神经微丝蛋白进行染色。结果鼠胚的神经元和神经轴突束可以在PLGA生物膜上延长和继续培养。这些神经元和延长后的轴突束可以保持正常形态和功能。结论这种复合神经元轴突束的三维支架结构具有人工神经的基本特征。本研究为用延长的神经轴突束修复神经缺损打下基础。

三维神经干细胞分化模型在神经药物检测中的应用

将神经干细胞接种在透明质酸支架进行三维(3D)培养,使用传统平面(2D)培养做对比,经诱导培养基进行1,7,14 d诱导分化。采用细胞免疫组织化学和Real-time PCR技术检测神经干细胞特异性标记物巢蛋白(nestin)、神经元微管蛋白(tubulin)及胶质细胞胶原纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)在蛋白水平和m RNA水平上的变化;CCK-8和活细胞染色技术检测神经细胞的增殖能力及神经细胞膜损伤修复效果。结果显示,神经干细胞在3D和2D培养条件下经诱导培养基诱导14 d后,tubulin表达量明显增加,而GFAP表达量降低,3D效果更加明显。CCK-8和活细胞染色结果显示,干细胞在3D培养条件下较2D培养条件下其分化和分化后的神经细胞膜损伤修复效果显著。三维培养模型能够对神经细胞分化后的药物损伤模型起到更好的保护作用。因此认为,3D透明质酸–神经细胞分化模型是更适合于构建体外神经药物筛选及安全性检测的优势模型。