重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备

目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的rESAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定。结果重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。结论成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

目的 构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法 以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果 重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论 成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。

ESAT6-CFP10融合蛋白基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-T-easy载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的重组载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pDE22分泌表达穿梭载体,以电穿孔方法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌。PCR筛选到的阳性克隆经温度诱导后,SDS-PAGE和Western印迹检测表达蛋白的正确性。结果:可表达出相对分子质量约23000的ESAT6-CFP10融合蛋白。Western印迹证明重组蛋白有较好的免疫原性。结论:获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,为结核病的预防奠定了一定的基础。

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的克隆表达及纯化

获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pPROEXTM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28 kD的esat6-cfp10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。

结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达(英文)

背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGHsp65为6.4kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%。未转染的Hela细胞则无荧光表达。④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白。结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒。

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的:构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法:从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和rpfD基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果:PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论:构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

目的研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因(atg)分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B-ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过BT-PCR检测到该细胞中有 Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。

结核分枝杆菌融合抗原Ag85B-ESAT6真核表达载体的构建及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板,将Ag85B和ESAT6编码基因进行PCR扩增,然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合,定向克隆至质粒Pvax1中,构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒Pvax1/AE.经单双限制性内切酶图谱、PCR产物及DNA测序分析等多种方法鉴定,证实Pvax1/AE真核表达质粒构建成功.为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础.

牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因的原核表达及抗原反应性分析

为了增强单个蛋白在牛结核病诊断中的敏感性和抗感染中的免疫原性,试验采用重叠延伸PCR将牛分枝杆菌cfp10基因与esat6基因融合,得到cfp10-esat6融合基因,再行重叠延伸PCR将cfp10-esat6融合基因与cfp7基因融合,得到融合基因cfp10-esat6-cfp7,并克隆至T-Vector pMD19中,构建重组质粒pMD-cfp10-esat6-cfp7。对pMD-cfp10-esat6-cfp7和pET-28a(+)进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将纯化的cfp10-esat6-cfp7连接到pET-28a(+)中,获得表达质粒pET-cfp10-esat6-cfp7,通过IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。对表达的融合蛋白进行镍柱纯化,通过Western-blot和间接ELISA分析其抗原反应性。结果表明:获得了融合基因cfp10-esat6-cfp7,表达了约36.3 ku的融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7。融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7与10份牛结核阳性血清反应的OD492值均在0.6以上,而融合蛋白CFP10-ESAT6与阳性血清反应的OD492值在0.1~0.3之间;融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7与10份牛结核阴性血清的OD492值也明显高于CFP10-ESAT6,其与牛结核阳性血清呈现良好的反应性。说明CFP10-ESAT6-CFP7融合蛋白具有作为牛结核病诊断抗原用于新型疫苗研究的潜在价值。