百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达，并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基，将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端，构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清，为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统，一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化，得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。

联合应用抗生素测定并鉴别超广谱和Ⅰ型β-内酰胺酶

目的 :联合应用抗生素测定并鉴别大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌产生的超广谱和Ⅰ型β 内酰胺酶。 方法 :用头孢噻肟 (CTX)、头孢他定 (CTD)、氨曲南 (ATN)、奥格门丁 (AOA)、头孢西丁 (CXT)和亚胺培能在MH琼脂上进行双纸片搭桥法检测和鉴别大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌的超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)及Ⅰ型β -内酰胺酶。 结果 :2 6 5株大肠埃希菌、95株肺炎克雷伯菌、6 7株阴沟肠杆菌均对亚胺培能敏感 ;对三代头孢菌素的耐药率分别为 2 3 .4%、36 .8%、5 8.2 % ,产生的能水解超广谱 β 内酰胺类抗生素的 β 内酰胺酶可分为两类 ,这些菌株对CXT有不同的耐药性 ;CTX +CTD +ATN的ESBLs检出率与单一CTX、CTD、ATN的检出率差异有显著性 ,与CTX +CTD的ESBLs检出率差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :应用不同抗生素可将水解超广谱 β 内酰胺类抗生素的 β 内酰胺酶分为ESBLs和Ⅰ型 ,有不同的耐药特点 ;联合应用两种以上抗生素可提高检出率 ,双纸片搭桥法适合临床使用 ,临床分离菌株应将超广谱和Ⅰ型 β

弓形虫主要表面抗原基因克隆及在大肠杆菌中的表达

为在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原（ＳＡＧ１），进一步研究其生物学功能。将ＳＡＧ１基因重组于ｐＧＥＭＥＸ－１融合型表达载体上，转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３），得到含重组表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１／ＳＡＧ１的工程菌。结果表明ＩＰＴＧ诱导表达后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测证实含有ＳＡＧ１蛋白。提示ｐＧＥＭＥＸ－１大肠杆菌系统可以表达具有免疫活性的ＳＡＧ１蛋白。

EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的将叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法。方法以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化。结果不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的最大EMA浓度为10μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的最小EMA浓度为0.5μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1%的活菌。结论 EMA-PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景。

徐州市1999年大肠埃希菌O_(157)∶H_7动物发病及带菌情况调查

目的 了解徐州市不同地区大肠埃希菌O157∶H7出血性肠炎流行季节动物的发病及带菌率。方法 在不同流行强度的地区设调查点 ,调查猪、鸡、牛、羊的发病情况 ;并采集其粪便 ,用免疫磁珠法进行病原分离培养。结果 6个调查点共调查动物 5 65头 ,发病 3 5头 ,罹患率 6 19% ;共采集猪、鸡、牛、羊等动物粪便标本 90 1份 ,分离出大肠埃希菌O157∶H713 0株 ,总带菌率 14 4% ,其中以牛、羊带菌率较高 ,分别为 2 1 9%、 19 4%。结论 在大肠埃希菌O157∶H7出血性肠炎流行季节各种动物都有不同比例发病 ,不同地区的动物带菌率也不尽相同。提示加强动物大肠埃希菌O157∶H7发病率及带菌率的调查对疫情分析与疾病控制有重要意义。

利用大肠埃希菌分泌表达乙型肝炎病毒核心抗原

目的:研究乙型肝炎病毒核心(C)基因在大肠埃希菌(E.coli)中的表达,以期获得分泌表达的具有良好免疫反应性和特异性的HBcAg。方法:构建重组质粒pET-3c-cAg、pET-30a-cAg、pGEX-4T-1-cAg,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HBcAg。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因正确克隆到E.coli各表达载体中。ELISA和Western blot分析表明,以pET-3c和pET-30a为表达载体能在E.coli分泌表达HBcAg,而以pGEX-4T-1为载体只能胞内表达,其中以pET-3c为载体的分泌表达量最高,培养上清中其效价为1∶128;用分泌表达的HBcAg作为诊断抗原检测抗-HBc阴阳性血清及国家参考品,符合率为100%。结论:成功获得HBcAg在E.coli的分泌表达,且其具有较高的特异性和免疫反应性。