肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株的构建及其生物学特性分析

目的利用λRed重组系统构建肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株,并研究其生物特性,对EspG蛋白进行初步生物信息学分析。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5’端与espG基因同源,3’端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段,制备含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细菌。将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中,利用pKD46介导的Red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157:H7 EDL933w espG基因,经PCR和测序验证后,通过革兰染色、测A600值、姬姆萨染色比较EHEC O157:H7 EDL933w野生株(Wild type,WT)与突变株的形态结构、生长能力和黏附性的差异性。以EDL933w菌株为研究对象,用在线软件VaxiJen v2.0对EspG蛋白抗原性进行评分,在ProParam软件中分析EspG蛋白序列的基本理化性质,利用SOPMA软件进行二级结构预测,采用SWISS-Model预测三级结构,通过Bcepred软件对EspG蛋白序列B抗原表位进行预测分析。结果PCR及序列分析证实构建了espG基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株,野生株与突变株均为革兰染色阴性短棒状杆菌,野生株对Caco2细胞的黏附率明显高于突变株(P<0.01)。应用Bcepred等软件对EspG蛋白表位参数综合分析,预测到10条B细胞潜在优势抗原表位。结论构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espG基因缺失株,探索了EHEC O157:H7 EDL933w野生株与突变株的生物学特性,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌LEE毒力岛中espG基因的调控机制提供实验基础。明确了EspG蛋白二三级结构以及其生物信息学特性,为优势表位的鉴定和筛选奠定了基础。