结核分枝杆菌espK基因G-四链体核酸序列多态性与表达调控功能研究

DNA的G-四链体(G-quadruplex,G4)是由富含串联重复的鸟嘌呤(guanine,G)的核酸序列折叠形成的四链体螺旋结构,目前认为其与基因表达调控和基因组稳定性有关。已有研究表明,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的esp K(Rv3879c)是构成ESX-1分泌系统的一个重要元件,其蛋白序列具有串联重复的GTPITP氨基酸序列多态性。本研究经核酸序列比对分析,确定该氨基酸序列多态性区域对应的模板链上存在G4序列,且该G4序列仅存在于结核分枝杆菌复合群。通过比对结核分枝杆菌临床分离株esp K基因的核酸序列,发现esp K基因的高频率G1573C突变位于G4序列。为研究该G4结构及基因表达调控功能,首先利用圆二色谱检测其核酸片段在钾离子存在条件下的光谱学特征,证实其可在体外形成具有顺式平行结构特征的G4,同义点突变G4会使其结构稳定性下降。采用重叠聚合酶链反应(overlapping polymerase chain reaction,overlapping PCR)构建含有G4突变的esp K表达质粒,获得重组表达菌株。通过实时定量PCR测定esp K重组表达菌株中基因转录水平变化,发现同义点突变G4后,其基因转录水平比野生型esp K重组菌株提升1.5倍(P<0.05)。此外,临床分离株中esp K出现的高频率G1573C突变会破坏G4结构,但蛋白免疫印迹检测结果显示esp K G1573C突变导致Esp K蛋白表达水平上升。以上结果提示,esp K的G4结构具有表达调控功能,该G4区域的序列多态性可能通过影响Esp K表达水平来调节ESX-1分泌系统的活性。

结核分枝杆菌RD区蛋白EspK的表达及对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响

目的:构建结核分枝杆菌Rv3879c基因的原核表达质粒并进行体外表达,研究Rv3879c基因编码蛋白EspK的生物学功能。方法:将Rv3879c基因克隆至原核表达载体pET-28a中,诱导表达后采用亲和层析纯化重组蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫小鼠制备血清多克隆抗体,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;体外实验检测EspK蛋白对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响;pulldown实验和质谱筛选宿主细胞内与EspK相互作用的蛋白;运用生物信息学软件ProtParam对蛋白进行理化性质和亲疏水性分析,TMHMM和SignalP 5.0 server预测蛋白的跨膜区和信号肽,NPS@SOPMA预测蛋白的二级结构,Scansite 4.0预测蛋白模体结构。结果:成功构建Rv3879c的重组原核表达质粒;SDS-PAGE和Western Blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得分子质量为74 kU的EspK蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度可达1∶409 600;EspK蛋白能促进小鼠巨噬细胞Ⅰ型干扰素的表达;成功筛选到4种与EspK相互作用的蛋白;生物信息学分析结果显示EspK蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽结构;EspK的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,有两个Erk1模体结构,可能参与多种生物学过程。结论:成功表达并纯化出重组蛋白EspK,EspK蛋白可促进巨噬细胞Ⅰ型干扰素的表达,利用生物信息学分析蛋白的结构及性质,为进一步研究EspK蛋白在结核病发生发展中的作用奠定了基础。

结核分枝杆菌RD区ESPJ和ESPK蛋白在诱导巨噬细胞极化中的作用

目的:探究结核分枝杆菌RD区ESPJ和ESPK蛋白在巨噬细胞极化中的作用。方法:将结核分枝杆菌RD区Rv3878和Rv3879c基因分别构建至原核表达载体,体外诱导表达并纯化重组蛋白GST-ESPJ和HIS-ESPK,用重组蛋白刺激巨噬细胞,Western Blot和ELISA法检测重组蛋白对巨噬细胞极化的影响;构建重组菌BCG-Rv3878和BCG-Rv3879c,用重组菌感染巨噬细胞,RT-qPCR、Western Blot和ELISA法检测重组BCG对巨噬细胞极化的影响,并采用菌落计数法检测重组BCG在巨噬细胞内的存活。结果:重组ESPJ和ESPK蛋白刺激巨噬细胞均可诱导其向M2型极化,转录因子c-Maf表达增加;成功构建重组菌BCG-Rv3878和BCG-Rv3879c,重组BCG感染巨噬细胞也能诱导M2型巨噬细胞极化,巨噬细胞内c-Maf转录因子表达明显升高;菌落计数结果显示重组BCG胞内存活增加。结论:结核分枝杆菌ESPJ和ESPK蛋白可诱导M2型巨噬细胞极化并促进细菌的胞内存活,这可能与结核分枝杆菌的免疫逃逸和潜伏感染有关,转录因子c-Maf在其中可能起到至关重要的作用。