六君子汤乙酸乙酯提取物干预CAFs条件培养基下EC9706细胞能量代谢的机制研究

目的探索六君子汤乙酸乙酯提取物(EAELD)对癌相关成纤维细胞(CAFs)条件培养基下食管癌EC9706细胞能量代谢影响的分子机制。方法噻唑蓝(MTT)法检测EAELD对EC9706增殖活性的影响;比色法检测EAELD对CAFs条件培养基(CAFM)下EC9706细胞上清中乳酸及葡萄糖含量的影响;Seahorse能量代谢分析系统检测EAELD对CAFM下EC9706细胞能量代谢的影响;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测EAELD对能量代谢相关分子mRNA及蛋白表达的影响。结果与DMEM相比,除10μg/mL组外,EAELD对EC9706细胞增殖活性均有明显抑制作用(P<0.05),选取抑制浓度(IC30)25μg/mL,半抑制浓度(IC50)40μg/mL,作为低、高剂量组进行后续实验。在CAFM培养的EC9706细胞各组中,EAELD低、高剂量组都能显著降低非线粒体耗氧、基础呼吸值、最大呼吸值、合成ATP耗氧量、备用呼吸能力、基础糖酵解、补偿糖酵解、糖酵解潜能(P<0.01),减少EC9706细胞上清乳酸含量(P<0.01),下调GLUT1的mRNA表达(P<0.05,P<0.01),下调p-PKM2、HK2、PKM2、MCT1蛋白表达(P<0.01);EAELD高剂量组能够下调EC9706细胞的线粒体耗氧与基础糖酵解比值(P<0.05),减少EC9706细胞葡萄糖摄取(P<0.05),下调p-PKM2、GLUT1的蛋白表达(P<0.01,P<0.05);EAELD低剂量组能够下调MCT1的mRNA表达(P<0.05)。结论六君子汤乙酸乙酯提取物能够干预CAFs条件培养基下EC9706细胞的能量代谢,其机制可能与EAELD调控HK2、PKM2、GLUT1、MCT1、MCT4的mRNA和蛋白表达相关。

六君子汤提取物抑制食管癌Ec9706细胞增殖及其对信号转导和转录活化因子3信号通路的影响

目的研究六君子汤提取物对食管癌Ec9706细胞增殖的抑制作用及其对信号转导和转录活化因子3(STAT3)信号通路的影响。方法于2013—2015年,采用70%乙醇提取六君子汤,正丁醇、乙酸乙酯及水提法过夜萃取,用MTT法观察提取物对Ec9706细胞活性的影响,选取最优提取部位,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法观察六君子汤乙酸乙酯部位对Ec9706细胞分泌相关细胞因子〔包括白介素6(IL-6)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)〕的影响,采用Western-blotting法测定六君子汤乙酸乙酯部位对食管癌Ec9706细胞STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达的影响。结果对照组、六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水提部位Ec9706细胞OD值比较,差异有统计学意义(F=448.90,P<0.01)。药物处理组对Ec9706细胞生长的抑制效果依次为:六君子汤正丁醇部位>六君子汤70%乙醇部位>六君子汤水提部位。六君子汤乙酸乙酯部位Ec9706细胞OD值比较,差异有统计学意义(F=19.78,P<0.001)。在250μg/ml时,六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水提部位对Ec9706细胞的抑制率分别为7.31%、23.24%、-25.07%,而在200μg/ml时,六君子汤乙酸乙酯部位对Ec9706细胞的抑制率为77.03%,抑制效果明显优于其他部位,故筛选的有效部位为六君子汤乙酸乙酯部位。应用概率法计算六君子汤乙酸乙酯部位抑制率IC35、IC50、IC70,代表低、中、高浓度,相应的浓度为63.08、93.00、133.70μg/ml。对照组、六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组IL-6、TGF-β1、VEGF水平比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其中六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组IL-6、TGF-β1、VEGF水平低于对照组(P<0.05)。对照组、六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组STAT3、p-STAT3表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组STAT3、p-STAT3表达水平低于对照组(P<0.05)。结论六君子汤不同试剂提取物中,乙酸乙酯提取物抑制食管癌细胞增殖作用最强,其抑制作用可能与调节STAT3信号通路有关。

黄连解毒汤用半仿生法提取药材组合方式的优选

目的 :选择半仿生法提取黄连解毒汤的最佳药材组合方式。方法 :以小檗碱、黄芩苷、栀子苷、总生物碱、总黄酮的含量、干浸膏得率及无水乙醇提取精制液的高效液相梯度洗脱总积分面积等为指标进行综合判定。结果与结论 :黄连解毒汤以黄连、黄柏与栀子合煎 ,黄芩单煎的提取方式为佳。

黄连解毒汤70%醇提物对小鼠S_(180)细胞MDR相关因子表达的逆转作用

目的观察黄连解毒汤70%醇提物对小鼠多药耐药(MDR)基因表达产物P170、肺耐药蛋白(LRP)和拓扑异构酶(TOPO)的影响,明确其干预MDR的分子生物学基础,指导临床应用其逆转MDR的产生。方法模拟临床PFC方案,建立小鼠S180肿瘤细胞MDR在体模型,同时给予黄连解毒汤70%醇提物10d,流式细胞仪荧光检测P170、LRP、TOPO。结果黄连解毒汤70%醇提物明显逆转S180肿瘤细胞MDR相关基因表达产物P170、LRP、TOPO的过度表达。结论黄连解毒汤70%醇提物可通过逆转相关生物活性物质的过度表达,逆转化疗诱发的肿瘤MDR的产生。

黄连解毒汤方药3种方法提取液成分比较

目的选择黄连解毒汤方药的提取工艺。方法以小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、1000D提取物为指标,采用半仿生提取法(SBE法)、醇提取法(AE法)、水提取法(WE法)进行比较研究。结果 6个指标综合评价Y值为:SBE液>AE法>WE液。结论黄连解毒汤以采用SBE法提取为佳。

补中益气汤水提物及萃取物对肠肌的作用

目的:观察补中益气汤水提物及其乙酸乙酯萃取部分对大鼠小肠平滑肌动力的影响。方法:采用大鼠离体小肠平滑肌的幅值、频率和基线变化为观察指标,比较补中益气汤水提物及其乙酸乙酯萃取物对离体肠肌自主收缩运动的影响。结果:补中益气汤水提物能明显抑制大鼠离体小肠平滑肌收缩的幅值和基线,明显增加收缩的频率,均有统计学意义(P<0.05);补中益气汤水提物的乙酸乙酯萃取物也具有相似的效果。另外,补中益气汤水提物及其乙酸乙酯萃取物均可缓解乙酰胆碱引起的肠肌痉挛。结论:补中益气汤水提物的乙酸乙酯萃取物对离体小肠平滑肌的作用类似于原复方水提物,该部分是补中益气汤复方的主要有效部位。

黄连解毒汤半仿生法提取工艺条件的优选

目的优选黄连解毒汤方药的提取工艺条件。方法采用半仿生法,在药材规格、煎煮温度、煎煮用水量等条件相同的情况下,用均匀设计U9(91×33)表,以盐酸小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、HPLC总面积、相对分子质量≤1 000的提取物为指标,综合评价,优选该方药的提取工艺条件。结果三煎用水的pH依次为A=2.061 4,B=7.051 7,C=8.964 2;提取总时间D=4.968 0。结论结合生产实际,确定该方药用半仿生法提取的工艺条件为:3煎用水的pH值依次为2.0,7.0,9.0,提取时间依次为2.0,1.5,1.5 h。

白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞NLRP3炎症小体的作用研究

目的:观察白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对巨噬细胞NOD样受体-3(NLRP3)炎症小体的影响。方法:用佛波酯(PMA)(10 ng·m L-1)刺激U937细胞48 h,诱导其成为巨噬细胞,观察不同剂量白术黄芪汤乙酸乙酯提取物(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100μg·m L-1)对细胞活力的作用,并选择合适的浓度。采用实时荧光定量(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)测定细胞中NLRP3,半胱天冬酶-1(caspase-1)的含量,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β的含量。结果:细胞计数试剂盒(CCK-8)实验表明,当药物浓度低于25μg·m L-1时,对细胞活力没有影响,当药物浓度高于50μg·m L-1时,对细胞活力有抑制作用(P<0.05),选择25μg·m L-1浓度进行后续实验。与空白组相比,LPS组细胞中NLRP3,caspase-1表达明显增加(P<0.01),细胞培养上清中的IL-1β浓度也明显增高(P<0.01)。白术黄芪汤乙酸乙酯提取物作用后,NLRP3,caspase-1,IL-1β表达均明显下降(P<0.05)。结论:白术黄芪汤乙酸乙酯提取物对LPS刺激的巨噬细胞NLRP3炎症小体有抑制作用。

黄连解毒汤有效成分的提取及其对体内白色念珠菌的清除作用

试验旨在研究黄连解毒汤有效成分的提取及对其体内白色念珠菌的清除作用。分别采用水煎煮和乙醇回流提取法,随后乙醇提取物用3种不同极性的有机溶剂萃取(正丁醇、乙酸乙酯、石油醚),以最小抑菌浓度为指标优化出最佳抑菌效果的提取工艺;观察给药前后系统性感染白色念珠菌小鼠肾脏、肝脏的真菌负荷量及活性氧(ROS)含量水平的变化,并检测血清中细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果显示,黄连解毒汤抑菌效果最优的提取工艺为:料液比1∶30,乙醇浓度60%,温度80℃,提取时间1 h,提取次数2次,测得乙酸乙酯萃取物MIC 90为0.3125 mg/mL。与模型组相比,黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(EAHD)高剂量组能显著降低小鼠肾脏真菌负荷量(P<0.05),完全治愈率达40%,并明显高于氟康唑组;EAHD低、中和高剂量组(50、100及200 mg/(kg·d))均能显著降低肝脏真菌负荷量(P<0.05),其中中剂量组和氟康唑组降低肝脏真菌负荷量效果接近。同时EAHD高剂量组能显著或极显著降低感染后小鼠肾脏和肝脏ROS含量(P<0.05;P<0.01);显著或极显著提高血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05;P<0.01),同时降低pro-IL-1β含量。综上所述,通过优化后的提取工艺得到的EAHD具有降低模型小鼠肾脏和肝脏ROS含量和调控炎症因子的作用,进而降低炎症反应,起到保护组织和抵抗白色念珠菌的作用。

基于GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS的麻黄汤化学成分识别

复方汤剂成分复杂,需要寻找一个高分离度、高稳定性的分析方法进行定性分析。采用梯度萃取法,将麻黄汤水煎液中的化学组分分为脂溶性和水溶性成分进行定性分析。采用GC-MS技术分离麻黄汤乙酸乙酯提取部分化学成分,质谱使用EI离子源,通过NIST MS Search 2.0标准质谱库定性分析,并结合相关文献资料,共鉴定出40个化学成分;采用UPLCQ-TOF-MS技术分离麻黄汤水提取部分化学成分,质谱使用ESI离子源,通过MZmine-2.9.1,Isotope Pattern软件以及质谱裂解规律定性分析,并对照对照品和结合相关文献资料,共鉴定出39个化学成分。该实验利用了GC-MS和UPLC-Q-TOF-MS对化学成分分析范围的差异,以及MS对未知化合物的准确鉴定优势,为麻黄汤药效物质的研究提供了依据,并为复方组分提供了一种简单快捷的分析鉴定方法。

黄连解毒汤联合氟康唑对耐药白念珠菌麦角甾醇的影响

目的：探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD）联合氟康唑（fluconazole,FLZ）对耐药白念珠菌生物膜麦角甾醇的影响. 方法：采用CLSI M27-A3的微量稀释法测定EAHD与FLZ对白念珠菌FLZ耐药株的MIC与SMIC80;棋盘稀释法测定EAHD与FLZ联用对白念珠菌的协同效应;稀释涂布平板法考察EAHD与FLZ联用不同时间对菌体的杀伤作用;分别用HPLC和qRT-PCR法检测耐药白念珠菌生物膜麦角甾醇含量及相关基因的变化. 结果：对于9株白念珠菌FLZ耐药株,EAHD对其MIC介于156~1 250 mgL-1,FLZ对其MIC介于256~2 048 mgL-1以上,二者联用后MIC显著降低,FICI（部分抑菌浓度指数）最低达0.066;EAHD单用对其SMIC80均高于1 250 mgL-1,FLZ单用对其SMIC80均高于512 mgL-1,最高可达2 048 mgL-1以上,联用组除个别组具有相加作用外也均有协同效应.时间杀菌（time kill,TK）实验显示当作用12 h,二者联用杀菌效应最强.HPLC结果显示联用组、EAHD组与空白组麦角甾醇量相比,分别降低了近85%,50%.qRT-PCR检测FLZ组ERG1,ERG2,ERG6,ERG7,ERG11均上调,ACS1,ACS2,MET6均下调;EAHD组所有基因均下调;联用组ERG2,ERG6,ERG11均显著上调,ERG1,ERG7,ACS1,ACS2,MET6均显著下调. 结论：EAHD协同FLZ抗白念珠菌耐药株,可能与抑制麦角甾醇合成相关基因的表达来降低麦角甾醇的合成有关,造成细胞膜损伤,抑制菌体生长.

黄连解毒汤乙酸乙酯提取物抑制白念珠菌菌丝的形成

目的:探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD)对白念珠菌菌丝形成的影响。方法:以0,78,312,1 250 mg·L-1EAHD干预白念珠菌6 h,采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜分别观察白念珠菌菌丝形态;固体培养基上观测菌落形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测白念珠菌菌丝形成相关基因HWP1,ALS3,UME6,SUN41,CSH1,Ca PDE2的表达量。结果:312,1 250 mg·L-1EAHD可显著抑制白念珠菌菌丝的形成及菌落的形态;qRT-PCR检测显示1 250 mg·L-1EAHD使HWP1,ALS3,UME6,CSH1表达分别下调4.13,3.64,2.46,2.75倍,SUN41表达上调7.26倍,Ca PDE2表达无变化。结论:EAHD可能通过抑制HWP1,ALS3,UME6,CSH1等相关基因的表达来抑制白念珠菌菌丝的形成。

黄连解毒汤醋酸乙酯提取物对白色念珠菌毒力因子的作用

目的探讨黄连解毒汤醋酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglianjiedu Decoction,EAHJD)对白色念珠菌毒力因子的作用。方法分别采用卵黄培养基法检测磷脂酶(PL)活力、牛奶平板法检测天冬氨酸蛋白酶(Sap)活力、橄榄油乳化法检测脂肪酶(Lip)活力;水-烃两项测定实验检测细胞表面疏水性(CSH);RT-PCR法检测毒力因子相关基因的表达。结果 EAHJD对PL的活力无影响;1 250μg/m L EAHJD可显著抑制Sap与Lip的活力,312μg/m L EAHJD效果次之;EAHJD对CSH呈现剂量依赖性抑制,CSH1分别下调了7.69、3.57、2.95倍;分泌型酶相关基因在EAHJD作用下呈现不同倍数的变化,其中PLC1、Sap2、Sap3、Sap9、Lip3、Lip4、Lip6下调,PLB1、PLC2、Sap10、Lip5无明显变化。结论 EAHJD可抑制白色念珠菌毒力因子的活力。

黄连解毒汤全方和不同极性部位的活性筛选

目的:研究比较黄连解毒汤全方水提液体系、水提液体系经有机溶剂梯度萃取后不同极性部位中指标性成分的变化,通过药效学筛选,探讨黄连解毒汤改善脑缺血、益智作用的有效部位及其化学组成,为该方的精制分离提供实验依据。方法:黄连解毒汤全方经水煎煮得水提液(部位Ⅰ),水提液浓缩后以石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇梯度萃取,得到石油醚萃取物(部位Ⅱ)、乙酸乙酯萃取物(部位Ⅲ)、水饱和正丁醇萃取物(部位Ⅳ)、残留水层上清液(部位Ⅴ)、残留水层沉淀(部位Ⅵ),以栀子苷、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素和汉黄芩素6种成分为对照,应用RP-HPLC确定各萃取物中6种指标性成分的含量;选用鼠源肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC-12细胞活性跟踪筛选,MTT法测定黄连解毒汤及各萃取部位对低糖DMEM和氯化钴诱导的PC-12细胞缺糖缺氧损伤的影响。结果:部位Ⅴ中各指标性成分含量较高,且6种指标性成分的比例与部位Ⅰ相似;部位Ⅰ,Ⅴ对PC-12细胞的缺糖缺氧损伤保护作用明显。结论:部位Ⅴ为黄连解毒汤改善脑缺血、益智作用的有效部位。

黄连解毒汤70%醇提物对MDR模型小鼠S180肿瘤细胞凋亡因子表达的影响

目的:观察黄连解毒汤70%醇提物对MDR模型小鼠S180肉瘤细胞凋亡因子的影响,探讨其逆转多药耐药作用的分子机制。方法:模拟临床PFC方案,建立小鼠S180肉瘤细胞多药耐药在体模型,同时给予黄连解毒汤70%醇提物灌胃10d,流式细胞仪荧光检测观察细胞凋亡因子Fas、Trail、细胞黏附因子CD54等指标。结果:黄连解毒汤70%醇提物增加耐药细胞凋亡因子Fas、Trail表达率,促进耐药S180细胞的凋亡,降低细胞黏附因子CD54的表达。结论:黄连解毒汤70%醇提物促进耐药细胞凋亡因子的高表达,是其逆转肿瘤多药耐药的途径之一。

黄连解毒汤半仿生提取法提取药材组合方式的优选

目的:优选黄连解毒汤药效物质提取时方药最佳组合方式。方法:将方药排列组合成15组,用半仿生提取法提取;以小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、HPLC总面积、≤1 000提取物为指标,将各指标测得值进行标准化处理,并经加权求和后得综合评价Y值,Y值大者为优。结果:7个指标综合评价Y值以AD+BC最大。结论:黄连解毒汤的提取,以黄连和栀子、黄芩和黄柏分别合提,再将提取液合并为最佳。

黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对光滑念珠菌黏附作用的影响

目的:探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD)对光滑念珠菌Candida glabrata黏附作用的影响。方法:采用二倍稀释法测定黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对光滑念珠菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);采用XTT还原法评价EAHD对光滑念珠菌黏附作用的影响;利用倒置显微镜、扫描电子显微镜与荧光显微镜观察EAHD对光滑念珠菌早期黏附形态学影响;采用半定量与实时荧光定量PCR检测其黏附相关基因EPA1,EPA6和EPA7的表达量。结果:EAHD对光滑念珠菌的MIC为320 mg·L-1,阳性对照药氟康唑对光滑念珠菌的MIC为1 mg·L-1;EAHD对光滑念珠菌2,4 h的黏附的干预作用较明显,其中对4 h效果优于2 h;PCR结果显示EAHD可显著抑制EPA1,EPA6和EPA7的表达。结论:EAHD可能通过抑制光滑念珠菌部分黏附基因的表达而抑制其早期黏附。