黄连解毒汤有效成分的提取及其对体内白色念珠菌的清除作用

试验旨在研究黄连解毒汤有效成分的提取及对其体内白色念珠菌的清除作用。分别采用水煎煮和乙醇回流提取法,随后乙醇提取物用3种不同极性的有机溶剂萃取(正丁醇、乙酸乙酯、石油醚),以最小抑菌浓度为指标优化出最佳抑菌效果的提取工艺;观察给药前后系统性感染白色念珠菌小鼠肾脏、肝脏的真菌负荷量及活性氧(ROS)含量水平的变化,并检测血清中细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果显示,黄连解毒汤抑菌效果最优的提取工艺为:料液比1∶30,乙醇浓度60%,温度80℃,提取时间1 h,提取次数2次,测得乙酸乙酯萃取物MIC 90为0.3125 mg/mL。与模型组相比,黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(EAHD)高剂量组能显著降低小鼠肾脏真菌负荷量(P<0.05),完全治愈率达40%,并明显高于氟康唑组;EAHD低、中和高剂量组(50、100及200 mg/(kg·d))均能显著降低肝脏真菌负荷量(P<0.05),其中中剂量组和氟康唑组降低肝脏真菌负荷量效果接近。同时EAHD高剂量组能显著或极显著降低感染后小鼠肾脏和肝脏ROS含量(P<0.05;P<0.01);显著或极显著提高血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05;P<0.01),同时降低pro-IL-1β含量。综上所述,通过优化后的提取工艺得到的EAHD具有降低模型小鼠肾脏和肝脏ROS含量和调控炎症因子的作用,进而降低炎症反应,起到保护组织和抵抗白色念珠菌的作用。

黄连解毒汤联合氟康唑对耐药白念珠菌麦角甾醇的影响

目的：探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD）联合氟康唑（fluconazole,FLZ）对耐药白念珠菌生物膜麦角甾醇的影响. 方法：采用CLSI M27-A3的微量稀释法测定EAHD与FLZ对白念珠菌FLZ耐药株的MIC与SMIC80;棋盘稀释法测定EAHD与FLZ联用对白念珠菌的协同效应;稀释涂布平板法考察EAHD与FLZ联用不同时间对菌体的杀伤作用;分别用HPLC和qRT-PCR法检测耐药白念珠菌生物膜麦角甾醇含量及相关基因的变化. 结果：对于9株白念珠菌FLZ耐药株,EAHD对其MIC介于156~1 250 mgL-1,FLZ对其MIC介于256~2 048 mgL-1以上,二者联用后MIC显著降低,FICI（部分抑菌浓度指数）最低达0.066;EAHD单用对其SMIC80均高于1 250 mgL-1,FLZ单用对其SMIC80均高于512 mgL-1,最高可达2 048 mgL-1以上,联用组除个别组具有相加作用外也均有协同效应.时间杀菌（time kill,TK）实验显示当作用12 h,二者联用杀菌效应最强.HPLC结果显示联用组、EAHD组与空白组麦角甾醇量相比,分别降低了近85%,50%.qRT-PCR检测FLZ组ERG1,ERG2,ERG6,ERG7,ERG11均上调,ACS1,ACS2,MET6均下调;EAHD组所有基因均下调;联用组ERG2,ERG6,ERG11均显著上调,ERG1,ERG7,ACS1,ACS2,MET6均显著下调. 结论：EAHD协同FLZ抗白念珠菌耐药株,可能与抑制麦角甾醇合成相关基因的表达来降低麦角甾醇的合成有关,造成细胞膜损伤,抑制菌体生长.

黄连解毒汤乙酸乙酯提取物抑制白念珠菌菌丝的形成

目的:探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD)对白念珠菌菌丝形成的影响。方法:以0,78,312,1 250 mg·L-1EAHD干预白念珠菌6 h,采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜分别观察白念珠菌菌丝形态;固体培养基上观测菌落形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测白念珠菌菌丝形成相关基因HWP1,ALS3,UME6,SUN41,CSH1,Ca PDE2的表达量。结果:312,1 250 mg·L-1EAHD可显著抑制白念珠菌菌丝的形成及菌落的形态;qRT-PCR检测显示1 250 mg·L-1EAHD使HWP1,ALS3,UME6,CSH1表达分别下调4.13,3.64,2.46,2.75倍,SUN41表达上调7.26倍,Ca PDE2表达无变化。结论:EAHD可能通过抑制HWP1,ALS3,UME6,CSH1等相关基因的表达来抑制白念珠菌菌丝的形成。

黄连解毒汤醋酸乙酯提取物对白色念珠菌毒力因子的作用

目的探讨黄连解毒汤醋酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglianjiedu Decoction,EAHJD)对白色念珠菌毒力因子的作用。方法分别采用卵黄培养基法检测磷脂酶(PL)活力、牛奶平板法检测天冬氨酸蛋白酶(Sap)活力、橄榄油乳化法检测脂肪酶(Lip)活力;水-烃两项测定实验检测细胞表面疏水性(CSH);RT-PCR法检测毒力因子相关基因的表达。结果 EAHJD对PL的活力无影响;1 250μg/m L EAHJD可显著抑制Sap与Lip的活力,312μg/m L EAHJD效果次之;EAHJD对CSH呈现剂量依赖性抑制,CSH1分别下调了7.69、3.57、2.95倍;分泌型酶相关基因在EAHJD作用下呈现不同倍数的变化,其中PLC1、Sap2、Sap3、Sap9、Lip3、Lip4、Lip6下调,PLB1、PLC2、Sap10、Lip5无明显变化。结论 EAHJD可抑制白色念珠菌毒力因子的活力。

黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对光滑念珠菌黏附作用的影响

目的:探讨黄连解毒汤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu decoction,EAHD)对光滑念珠菌Candida glabrata黏附作用的影响。方法:采用二倍稀释法测定黄连解毒汤乙酸乙酯提取物对光滑念珠菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);采用XTT还原法评价EAHD对光滑念珠菌黏附作用的影响;利用倒置显微镜、扫描电子显微镜与荧光显微镜观察EAHD对光滑念珠菌早期黏附形态学影响;采用半定量与实时荧光定量PCR检测其黏附相关基因EPA1,EPA6和EPA7的表达量。结果:EAHD对光滑念珠菌的MIC为320 mg·L-1,阳性对照药氟康唑对光滑念珠菌的MIC为1 mg·L-1;EAHD对光滑念珠菌2,4 h的黏附的干预作用较明显,其中对4 h效果优于2 h;PCR结果显示EAHD可显著抑制EPA1,EPA6和EPA7的表达。结论:EAHD可能通过抑制光滑念珠菌部分黏附基因的表达而抑制其早期黏附。