小鼠肺腺癌模型的建立及肿瘤病理分析

目的用乙基亚硝脲(ENU)在BABL/c小鼠建立肺腺癌模型并对ENU所诱发的肺腺癌进行病理观察。方法妊娠17d的SPF级母鼠腹腔接受ENU或缓冲液注射,在子代鼠的鼠龄满32周时收获其全肺标本,对肺组织进行常规石蜡半连续切片,HE染色,镜下观察肿瘤病理。结果 ENU经胎盘一次性诱发子代鼠多发性肺肿瘤形成,病理显示这些肿瘤为处于不同发展阶段的腺瘤和腺癌,腺癌的类型有细支气管肺泡癌样腺癌(雌性:5/6,雄性:4/6)和分化不等的腺癌(雌性:4/6,雄性:5/6),诱癌频率在雌、雄性小鼠均为5/6,癌变频率在雌性16/43,雄性12/31。结论成功建立了小鼠肺腺癌模型,肿瘤病理的多样性提示癌变机制在分子水平的复杂性。

乙基亚硝基脲诱导转基因小鼠基因突变的研究

[目的 ]用乙基亚硝基脲 (ENU)进一步验证携带xylE基因的转基因小鼠在体内基因突变研究中的应用价值。 [方法 ]用ENU对转基因小鼠进行诱变处理 (i.p .5 0mg/(kg·d) ,连续 5d)后 ,从脾脏组织DNA中回收带有靶基因xylE的pESnx质粒 ,通过电穿孔法转化大肠杆菌 ,筛选突变体 ,检测突变率 ,并对突变靶基因进行测序分析以确定突变类型。 [结果 ] (1)ENU诱发转基因小鼠脾脏组织xylE基因的突变率为 1 2 48× 10 -4 ,显著高于自发突变率 ;(2 )ENU诱发基因突变的类型包括碱基的颠换、转换以及由于碱基的缺失或插入所引起的移码突变。 [结论 ]该转基因小鼠是检测体内基因突变的一种有效的动物模型。

N-乙基-N-亚硝基脲的合成和动物实验

作者在国内首次合成了N-乙基-N-亚硝基脲,对其熔点、溶解度、红外光谱和元素进行了测定和分析,动物实验表明其对大鼠神经系统有高度的致癌性。

乙基亚硝基脲诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因杂合性缺失

目的探讨tk基因分子突变的类型,对不同剂量乙基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变的杂合性缺失(LOH)进行分析,为环境致突变剂检测和突变机制研究提供依据。方法使用乙基亚硝基脲10μg/mL和100μg/mL剂量对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别测定细胞毒性、细胞接种效率、相对存活率、相对悬浮生长率和突变频率等。挑选经ENU诱导的tk基因突变子(tk-/-)和自发突变体,提取基因组DNA,应用等位基因特异性PCR扩增、杂合性缺失分析等技术,分析其杂合性缺失的发生。结果低剂量和高剂量诱导突变体的tk基因LOH发生率分别为73.5%和69.1%。LOH分析结果显示,诱导突变体的LOH在大集落与小集落之间差异具有显著性(P<0.05)。结论功能性等位基因缺失是ENU诱导tk基因分子突变的重要形式之一,不同剂量可能具有不同的突变机制。

大鼠α-谷氨酰转肽酶阳性肝细胞在无血清培养液中的生长

原位肝胶原酶灌流分离出经化学致癌剂诱发的大鼠癌前期肝细胞,用“淘洗”技术纯化γ-谷氨酰转肽酶(GGT)阳性肝细胞,置无血清的DMEM:F12(1:1)培养液中培养。结果表明,GGT阳性或阴性肝细胞均不能在此培养液中长期生长。而经乙基亚硝基脲(ENU)处理4h的肝细胞,只有GGT阳性肝细胞能在此无血清培养液中长期生长并传代,其形态及排列类似正常肝细胞,电镜下可见典型的连接复合体和毛细胆管,但核较大;组织化学及免疫组织化学方法证实这些细胞仍维持GGT阳性,且能产生白蛋白,故此种细胞可能是介于正常肝细胞与肝癌细胞的癌前期细胞。

遗传性瞳孔异位小鼠及其突变基因的染色体定位

目的研究乙烷基亚硝基脲(ENU)诱变获得的遗传性瞳孔异位(B6-24#)小鼠的病变特征、遗传模式及突变基因在染色体上的位置。方法用瞳孔异常杂合子与正常C57BL/6(B6)小鼠配种,记录后代突变小鼠与正常小鼠数目,采用卡方检验确定遗传模式。繁殖[(B6×D2)×B6]F2及少量的[(B6×D2)F1×D2]F2突变小鼠,用平均分布于小鼠常染色体上的39个微卫星标记对突变基因进行染色体扫描,采用计算最大优势值(LODS)法判定突变基因与微卫星是否连锁并根据重组率计算突变基因的位置。结果初步诊断B6-24#为遗传性瞳孔异位,呈单基因显性遗传,外显率为85·71%。基因组扫描发现,微卫星D2Mit17与突变基因最大LODS为3·27,确定连锁。继续选用接近突变基因的D2Mit398、D2Mit259与其进行连锁分析,结果突变基因与D2Mit398、D2Mit259的重组率分别为5·45%±2·16%、0·90%±0·90%。突变基因被定位于距着丝粒约64·5cM处。在此区域附近未发现明显的候选基因。结论研究成功定位了小鼠瞳孔异位基因,有望为人类类似疾病提供一种新的小鼠模型。

经胎盘诱发大鼠脑肿瘤不同阶段p53表达的研究

目的 :利用亚硝基乙基脲 (ENU)经胎盘诱发大鼠脑肿瘤的模型 ,对肿瘤发生前、后各个阶段的p5 3基因的变化进行连续地观察和研究。方法 :①取孕 17d大鼠 ,腹腔注射NEU(80mg kg)建立子代鼠脑肿瘤模型 ;②应用免疫组化的方法 ,对子代鼠 6 0d、90d、12 0d和 15 0d鼠脑p5 3蛋白表达进行观察。结果 :子代鼠出生后 6 0d、90d、12 0d和 15 0d ,特别是 6 0d和 90d组 ,异常p5 3蛋白的表达增加 ,肿瘤内与瘤周组织织间差异有统计学意义。结论 :异常p5 3蛋白的表达存在于肿瘤发生前、发生早期及发生后各阶段 ,进一步说明p5 3基因突变及其表达产物功能缺乏是脑胶质瘤起源的重要原因。p5 3基因的功能失常仅可能是导致基因链活动紊乱的因素之一 ,而肿瘤的形成还可能需要其他因素点燃。

经胎盘诱发脑肿瘤动物模型的建立及bFGF对其发生发展的影响

孕鼠经腹腔一次性给予亚硝基乙基脲（ENU）可引起子代鼠中较高的脑肿瘤发生，并且与人类脑肿瘤发生的高峰期、类型及好发部位相似。建立该肿瘤模型其方法简便、经济、观察时间短，为肿瘤发生前、肿瘤发生早期及发生后不同阶段的观察提供了条件。经脑立体定向一次性颞叶实质内注射碱性成纤维细胞生长因子（b－FGF）其肿瘤内的新生血管面积和血管数既高于对照组肿瘤内，也高于同组瘤外正常组织内的新生血管面积和血管数。提示bFGF可以促进肿瘤内新生血管形成，也可能是影响肿瘤生长的原因。

乙酰基亚硝基脲诱变的一种角膜混浊小鼠及其突变基因的染色体定位

背景乙酰基亚硝基脲（ENU）诱导小鼠基因突变是研究基因功能及建立人类疾病动物模型的一种有效手段。目的研究ENU诱变获得的1只角膜混浊小鼠角膜组织形态变化，并对其突变基因进行染色体定位。方法选用8-10周龄的C57BL／6J（B6）雄鼠40只，腹腔内注射ENU。将注射后的雄鼠与同品系母鼠交配，在其后代小鼠中筛选眼部突变个体，并将突变个体与同品系小鼠配种以确定是否遗传。对ENU诱变获得1只角膜混浊小鼠的角膜行组织病理学观察。繁殖[（B6xD2）F1xB6]N2角膜混浊小鼠，用平均分布于小鼠染色体上的微卫星标记对N2小鼠染色体进行扫描。采用优势对数计分法（LOD）判定突变基因与微卫星是否连锁。结果将角膜呈现混浊小鼠与B6背景小鼠配种，在其59只后代中出现19只类似表型的突变小鼠。角膜组织病理学检查发现，该例角膜混浊小鼠角膜基质增厚，出现新生血管和炎性细胞浸润，成纤维细胞明显增多。突变基因与微卫星间的连锁分析发现，26个N2样品中突变基因与位于小鼠2号染色体63．42eM处的D2Mi307位点发生3例交换，LOD值为3．79，该突变基因位于小鼠第2号染色体。结论成功获得角膜混浊小鼠并将其突变基因初步定位于2号染色体，有望为人类角膜混浊疾病研究提供一种新的小鼠模型。

乙基亚硝基脲对人白血病细胞HPRT基因的影响

目的 探讨乙基亚硝基脲 (ENU)诱导人次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (HPRT)基因突变的分子图谱和发生机制。方法 采用单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重聚合酶链反应扩增和电泳分析等方法。结果 随着ENU剂量的增加 ,细胞接种存活率非常显著下降 (10 0～ 2 0 0 μg/ml剂量组 )、突变频率显著升高 (12 5～ 2 0 0 0 μg/ml剂量组 )。自发突变没有全部基因外显子缺失型 ,只有 7 7%检测出单个外显子缺失 ;而ENU诱发突变中却有 79 7%显示缺失改变 ,其中缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子 ,且诱发突变中大多数是多个外显子连锁缺失 (88 1% )。结论 ENU诱发HPRT基因突变图谱与自发突变完全不同 ,易诱发较大遗传结构改变 。

乙基亚硝基脲诱发转基因小鼠体内基因突变及微核形成

目的 用致突变剂乙基亚硝基脲 (ENU)验证基于pUC 118NX质粒的转基因小鼠用于体内诱变研究的可行性。方法 用酶切、环化方法从经过和未经过ENU诱变处理的xylE ,C5 7BL 6J转基因小鼠脾脏组织DNA中重新分离pUC 118NX质粒 ,使其转化DH10B宿主菌并铺氨苄青霉素抗性平板培养后喷洒邻苯二酚溶液 ,通过菌落颜色不同筛选突变体 ,并对突变靶基因xylE测序分析以确定突变类型。同时取该转基因小鼠外周血及骨髓细胞 ,观察ENU对转基因小鼠微核形成率的影响。结果 转基因小鼠脾脏组织xylE基因自发突变率 <4 79× 10 - 5,经ENU( 5 0mg kg× 5 )处理后 ,脾组织基因诱发突变率为 19 83× 10 - 5,两者差异有显著性。ENU诱发小鼠脾组织基因突变的类型包括颠换( 5 0 % )、单 /双碱基插入 ( 3 7 5 % )和转换 ( 12 5 % )。经ENU( 5 0mg kg× 5 )处理后 ,转基因小鼠外周血细胞微核率 ( 7 6‰ )和骨髓细胞微核率 ( 8 8‰ )均明显高于溶剂对照组 ,表明ENU可诱发该转基因小鼠染色体畸变。结论 基于pUC 118NX质粒的xylE ,C5 7BL 6J转基因小鼠可用于同时测定体内基因突变和染色体畸变 ,有望成为一种新的评价化学物遗传毒性的检测系统。

乙基亚硝基脲构建β-地贫小鼠模型的初步研究

目的以MCHC、MCH和Hb A、Hb A2、Hb F等血象为观察指标,探讨乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)复制β-地贫模型的可行性。方法实验设模型组和正常对照组两组。模型组:先给雄性DBA/2J小鼠腹腔注射乙基亚硝基脲(200 mg/kg体重),经9周诱发遗传基因突变,然后将其与正常雌性C57BL/6J小鼠杂交繁育出具有β-地中海贫血特征的模型杂交F1代小鼠。正常对照组:将正常雄性DBA/2J小鼠与正常雌性C57BL/6J小鼠杂交繁育出正常杂交F1代小鼠。结果与正常杂交F1代小鼠比较,模型杂交F1代的部分小鼠血MCHC、MCH、Hb A显著降低,Hb A2和Hb F显著升高(P<0.05或P<0.01)与临床初步诊断患者为β-地中海贫血的相应血象指标的变化趋势相一致。结论乙基亚硝基脲可诱发小鼠类似β-地中海贫血。