真核生物转录因子及其研究方法进展

真核生物基因的表达调控是当前分子生物学最前沿的研究领域之一,而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步,由于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA之间的相互作用,以及一些复杂大分子复合物的形成,导致真核生物转录水平的调控是一个多级的复杂过程。转录因子即反式作用因子在转录调控中可以直接或间接的识别或结合在顺式作用元件8 bp^112 bp核心序列上,参与调控靶基因的转录效率。因此,转录因子与调控序列的相互作用在决定某个基因是否表达中占据核心位置。随着对转录因子及其研究方法的深入研究,尤其是近几年染色质免疫沉淀及生物信息学的发展,人们将会进一步研究转录调控的机制及细胞行为和疾病的发生机理。

猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究

目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小鼠 ,以空载质粒pcDNA为阴性对照 ,PBS为空白对照 ;采用流式细胞仪 (FACS)、淋巴细胞增殖试验(MTT法 )分别对小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行了检测。结果 :pcDNA IL 2与pcDNA PRRSV ORF5共同免疫小鼠后外周血对ConA有明显的反应性 ,CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数在免疫后 7天显著超过对照组 ,共同组与单独pcDNA PRRSV ORF5组有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :pcDNA PRRSV ORF5免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的细胞免疫应答 ,猪pcDNA IL 2能够显著增强pcDNA PRRSV ORF5诱导小鼠细胞免疫的能力。

血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究 Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。

鸭IFN-α真核表达质粒基因枪免疫对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭细胞免疫调节作用初探

为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接种鸭瘟(DP)弱毒疫苗。接种后第3、7、14、21、28、35、49、63、84天采血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鸭外周血中T淋巴细胞转化效果;第7、14、21、28、35、49天采血用流式细胞仪(FACS)测定CD3+T淋巴细胞数量的动态变化。结果发现:①T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值),不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭外周血T淋巴细胞转化功能于第3-84天均高于PBS和空载体pcDNA对照组,其中第3-84天1μg/只组极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组;1μg/只组第3-35天显著(P≤0.05)高于3、6μg/只组;3μg/只组于第14-35天高于6μg/只组,但差异不显著(P≥0.05);pcDNA对照组略高于PBS对照组,但差异不显著(P≥0.05);②CD3+T淋巴细胞数量变化,不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭于第7-49天均高于PBS和pcDNA对照组,其中1μg/只组于第14-49天极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组于第21-49天极显著(P≤0.01)高于PBS对照组和显著(P≤0.05)高于pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组;1、3和6μg/只组之间差异不显著(P≥0.05);pcDNA组于第14-49天高于PBS组,但差异不显著(P≥0.05)。研究表明,pcDNA-SDIFN-α提前15 d免疫能显著增强DP弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力,以基因枪免疫1μg/只的效果最佳,它是一种良好的增强DP弱毒疫苗细胞免疫的分子佐剂。

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。

pcDNA3.1(+)/t-PA真核表达质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达

目的 利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物 (t- PA)基因并构建一种能在血管内皮细胞 (VEC)中高效、安全表达 t- PA的 pc DNA3.1(+) / t- PA真核表达重组质粒。方法 采用高效 Trizol试剂快速从胎儿肺组织中提取总 RNA,RT- PCR获得 t- PA c DNA,并将真核表达质粒 pc DNA3.1(+)和 t- PA基因片段分别双酶切 ,将回收的 pc DNA3.1(+)大片段 (5 .0 kb)与 t- PA基因片段 (1.9kb)重组。对 pc DNA 3.1(+) / t- PA质粒进行酶切鉴定和测序。脂质体介导 pc DNA3.1(+) / t- PA转染血管内皮细胞 ,并用 RT- PCR法和 EL ISA法分别从 m RNA水平和蛋白质水平检测 t- PA的表达情况。结果 成功地从胎儿肺组织中克隆了 t- PA基因 ,并构建了以 pc DNA 3.1(+)为载体的真核表达质粒载体。pc DNA3.1(+) / t- PA转染血管内皮细胞后 ,t- PA表达增加 ,(n=6 ,P<0 .0 1)。结论 含t-

日本血吸虫Dna J-类似蛋白基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建日本血吸虫Dna J-类似蛋白真核表达载体,以待进行动物实验观察其保护性免疫作用。方法 在已构建的克隆载体p Bluescript SK+ / Sj Dna J-类似蛋白(保存于日本血吸虫成虫c DNA文库中)的基础上,根据Dna J-类似蛋白基因序列设计一对引物,PCR扩增后与T载体连接,T/ A克隆筛选后经Eco R 和Xba 双酶切,连接入真核表达载体pc DNA3.1(+) ,构建重组质粒并转化入DH5α,再进行重组基因鉴定。结果 此重组体转入了完整的日本血吸虫Dna J-类似蛋白基因。结论 构建了日本血吸虫Dna J-类似蛋白真核表达载体。

两种不同的转基因细胞构建体系的比较

目的:比较目的基因在两种不同表达体系构建的转基因细胞上的表达,选择更好的构建体系。方法:脂质体法将重组真核细胞表达载体pcDNA3/FD-L1导入L929细胞,G418(600μg/ml)筛选抗性细胞株,同时将重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/PD-L1与辅助载体共转染293T细胞,包装病毒颗粒,其上清感染L929细胞后,经Zeocin(500μg/ml)筛选抗性细胞。流式细胞仪(FCM)检测目的蛋白在两种细胞膜上的表达。结果:两种体系对目的基因的瞬时表达无明显差别;用pcDNA3构建的转基因细胞膜上目的分子表达稳定性差,表达率低,而用pGEZ-Term构建的则目的蛋白稳定高表达,表达率近100％。结论:两种构建体系均能瞬时表达目的分子,pGEZ-Term表达体系更适于构建长期稳定表达目的基因的转基因细胞。

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的 利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物 (t PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t PA质粒载体。 方法 采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA ,RT PCR获得t PAcDNA ,扩增、纯化、回收t PA基因片段并将质粒 pcDNA3.1和t PA基因片段分别双酶切 ,前者纯化回收大片段 ,后者纯化回收 1 .9kb片段 ,再将回收的pcDNA3.1大片段与t PA基因片段 (1 .9kb)重组。对重组pcDNA3.1t PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定 ,并测序。结果 成功地从胎儿肺组织中克隆了t PA基因 ,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体。结论 含t

细胞周期调控的一个重要元素—CDC48

细胞周期调控研究已成为当前生物学领域的一大热门课题,对哺乳动物和酵母细胞周期调控的研究已经非常深入且日臻成熟;植物细胞周期调控研究起步相对较晚但近些年来在该领域也取得了很大的进展。CDC48是真核生物中普遍存在的一个重要的细胞周期调节基因,其蛋白产物CDC48也是研究较为成熟的一个周期蛋白,国外生物学者对该基因已经开展多年研究,而国内尚未见任何报道。主要论述近几年来有关真核生物酵母、哺乳动物和植物CDC48的研究现状及发展趋势。

pcDNA3.1表达载体转染对细胞生长的影响

为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响，通过脂质体介导将ｐｃＤＮＡ３．１（＋）表达载体ＤＮＡ转染鼻咽癌细胞系 ＨＮＥ１，Ｇ４１８筛选后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定稳定表达细胞株，以 ＨＮＥ１细胞为对照，观察ｐｃＮＡ３．１（＋）／ＨＮＥ１克隆细胞的生物学特性；结果显示，在ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＨＮＥ１阳性克隆中，一株细胞克隆培养过程中发生自溶性死亡，一株细胞生长明显受到抑制，另一株细胞生长无明显影响，揭示在宿主细胞中ｐｃＤＮＡ３.１（＋）ＤＮＡ与宿主基因组ＤＮＡ发生了随机整合，从而表现不同的细胞生物学改变。

miR-338对人肝癌细胞增殖及迁移的影响

目的:观察过表达miR-338对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及迁移能力的影响。方法:化学合成miR-338寡聚核苷酸,并行测序确认。利用pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR质粒构建miR-338真核表达载体。pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR-338质粒载体瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR-338的mRNA表达水平。高表达miR-338后,CCK-8法和划痕实验分别检测SMMC-7721细胞增殖能力及迁移能力的变化。结果:设计的miR-338序列与寡核苷酸测序结果比对,匹配程度达100%。pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR-338质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞miR-3 3 8的表达量与对照组相比显著增加(P<0.05)。miR-338过表达SMMC-7721细胞的增殖能力与各对照组相比均有显著下降(P<0.05);miR-338过表达细胞迁移速度降低。结论:上调的miR-338可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖及迁移能力。

人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用

目的 克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA ,并构建其真核表达载体 ,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法 从KG 1a细胞提取总RNA ,RT PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定 ,构建其真核表达载体pcD NA3 1 CD34。选取 4～ 6周龄的BALB/c小鼠 12只 ,随机分为 3组 ,预先在股四头肌注射 2 5 %的蔗糖溶液 5 0 μl,然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3 1以及PBS稀释的pcDNA3 1 CD34,每 2周 1次共 3次。免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况。结果 所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长 886bp ,扩增片段大小与理论值相符 ,测序结果与文献报道完全一致 ,并且在 5′端引入HindⅢ酶切位点 ,3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA。随后将其定向插入真核表达载体 pCD NA3 1中 ,称之为pcDNA3 1 CD34,经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实 pcDNA3 1 CD34真核表达载体构建成功。FACS检测结果表明 ,用pcDNA3 1 CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅 1/ 4只在免疫结束后的第 2～ 6周有较低滴度的CD34抗体产生 ,其余 3只血清中均未检测到CD34抗体。结论 成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体 pcDNA3 1 CD34。

人黑色素瘤抗原MAGE-3肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性的观察

目的通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗,并观察其对HLA-A*0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法用RT-PCR的方法,从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段,分别将其插入到pcDNA3.1/V5-His真核和pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达;将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后,采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HLA-A*0201转基因小鼠,LDH方法检测CTL活性。结果酶切结果证实,成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体,并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达,原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫,镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后,可成功地诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性。结论成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原,为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。

凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

目的构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体,为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3。将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点,构建重组凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3,将该重组表达载体分别以限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切鉴定,进一步将初步鉴定显示插入目的基因的质粒进行测序鉴定。结果测序结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Noteborn报告的凋亡素基因序列一致,同源性为100%。在其起始密码子前添加了Kozak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE。结论采用两次PCR法可将提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端,并构建成凋亡素真核表达载体。

甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达。提取流感病毒Influenza A/FM/1/47(H1N1)RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达。甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础。

EBV-LMP1 cDNA克隆与真核表达载体的构建及体外表达

目的:从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)cDNA,构建真核表达质粒pIRES-LMP1,并检测其在体外的表达。方法:利用分子生物学技术,提取鼻咽癌总RNA,逆转录PCR获得LMP1cDNA,克隆入pDriveCloningVector并测序,利用引物上设计的酶切位点NheI和EcoRI将LMP1插入真核表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Westernblot检测LMP1的表达。结果:扩增的LMP1cDNA为1301bp,核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1分子。结论:实验所构建的pIRES-LMP1表达质粒能在体外表达LMP1分子。

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增 ,克隆构建真核表达质粒pcDNA3 /HSV ⅡTK/As。方法 从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV Ⅱ )Sav株感染的Hep 2细胞上清液中提取HSV 2基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法扩增胸苷激酶 (TK )基因 ,将扩增的片段克隆入载体 pcDNA3 中 ,挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切 pcDNA3 /HSV ⅡTK ,得到目的基因TK ,将其克隆于已构建的真核表达载体 pcDNA3 /As上。结果 HSV Ⅱ TK基因全部编码区为 112 8bp ,基因序列与 genebank中报道相符。新质粒 pcDNA3 /HSV ⅡTK/As经限制性核酸内切酶 (BamHⅠ ,HindⅢ )酶切后得到 70 0bp(As)及 10 0 0bp(HSV ⅡTK)相应基因片段。 结论 本研究成功构建 pcDNA3 /HSV ⅡTK /As真核表达质粒。