紫云英根瘤菌菌株107exo基因簇的遗传互补分析

紫云英根瘤菌菌株１０７经Ｔｎ５插入诱变，得到１２株胞外多糖缺陷型变种，以质粒ｐＭＮ２为载体，从其中７株ＥＰＳ－变种内分别构建了７个Ｒ－Ｐｒｉｍｅ质粒（ｅｘｏＲ＇），大部分变种的ＥＰＳ－表型可被ｅｘｏＲ＇互补，恢复野生型表型（ＥＰＳ＋）。互补表明，１２株ＥＰＳ－变种可分为６个不同的互补群，其中５个在遗传上连锁。ｅｘｏＲ＇酶切分析，除ｅｘｏＲ＇－０２，ｅｘｏＲ＇－０４外，其余５只的外源片段均整合于ＰＭＮ２的两同向重复序列ＩＳ２１之间。

影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株107的3个胞外多糖缺陷突变株NA－01、02、04不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以NA-01突变位点的DNA片段为探针，从可互补这3个变种的exoR′－11质粒上亚克隆到2．6kb的DNA片段。互补试验表明，2．6kb的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型，而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力。2．6kb片段经Tn5定位突变后丧失这种恢复能力，表明该片段带有对应于3个变种的野生型基因。

紫云英根瘤菌107菌株exo基因簇非连锁突变位点的克隆

用鸟枪法从3株紫云英根瘤菌107菌株的胞外多糖合成缺陷变种（Exo-）NA－05、NA－07和NA－08中克隆获得含有107菌株exo基因及Tn5的exo::Tn5片段。以pRK415为载体构建107菌株EcoRI酶切后DNA片段的部分基因库，用exo::Tn5做探针原位杂交得到一个阳性克隆。该克隆的外源片段4．2kb能恢复3个变种的多糖表型及结瘤固氮能力。酶切分析和Southern杂交表明，3株变种中Tn5插入位点相近。

棉花EXO70基因家族全基因组的鉴定及种间比较

【目的】当前四倍体棉花的主栽品种是陆地棉与海岛棉,陆地棉产量高且适应性好,海岛棉纤维品质优异但产量一般。EXO70是胞外分泌体(exocyst complex)中的关键亚基,在植物生长发育、胁迫响应等方面发挥重要作用。通过全基因组水平鉴定和分析陆地棉与海岛棉EXO70基因家族成员,并研究其在纤维发育、环境适应等方面的功能,有助于揭示陆地棉与海岛棉种间性状差异形成的分子基础。【方法】从拟南芥数据库(TAIR)获取EXO70家族蛋白序列作为参考序列,采用HMMER、ExPASy、MEME、TBtools等分析工具对陆地棉TM-1和海岛棉Hai7124基因组中EXO70家族成员进行鉴定与分析,系统比较该家族在基因表达模式、重要农艺性状的相关性、逆境响应等方面的异同点。【结果】通过对陆地棉和海岛棉的基因组水平分析,均鉴定出54个EXO70家族成员,根据系统进化发育可将其分为8个分支。陆地棉和海岛棉同源基因可一一对应,分布在陆地棉与海岛棉的20条染色体上,绝大多数成员为单外显子,但是两者间有12对同源基因在阅读框序列上存在较大差异。陆地棉与海岛棉大部分同源基因表达模式类似,但在同一纤维发育时期表达量存在差异,如分支A中的GH_A04G1208与同源基因GB_A04G1253。重要农艺性状关联分析中发现,海岛棉有16个EXO70基因与纤维品质性状显著相关,多于陆地棉;陆地棉有13个基因与产量性状衣分显著相关,多于海岛棉。发现部分性状关联的差异可能由海陆种间的基因结构差异造成,如GH_A11G3714和GB_A11G3791。在不同逆境胁迫下,陆地棉中有25个基因受诱导,显著多于海岛棉中10个受诱导基因。【结论】在棉花四倍体形成、分化与驯化过程中,陆地棉与海岛棉EXO70家族基因序列结构相对保守,基因表达模式也保持较高的一致性。海岛棉有更多的EXO70基因与纤维品质性状相关,陆地棉有更多的基因与产量性状相关且对环境逆境更为敏感。

下呼吸道感染来源铜绿假单胞菌毒力基因与氟喹诺酮类药物的耐药性研究

目的检测下呼吸道感染患者分离的铜绿假单胞菌毒力基因exoS、exoU表达及与氟喹诺酮耐药性的相关性。方法收集2015年10月至2016年3月住院患者痰标本中分离的铜绿假单胞菌,以液体稀释法测定药物敏感性;PCR法扩增exoS、exoU基因。结果检出铜绿假单胞菌46株,exoS、exoU基因阳性率分别为86.96%(40/46)和69.57%(32/46),检出率最高的基因型是exoS+/exoU+(60.87%,28/46)。其中36.96%(17/46)为多重耐药菌(MDR)。氟喹诺酮不敏感(FQNS)菌株78.95%(15/19)为MDR,89.47%(17/19)表达exoU基因,明显高于氟喹诺酮敏感(FQ-S)菌株(P<0.05)。与FQ-S菌株相比,FQ-NS菌株耐药严重,对氨曲南和头孢吡肟耐药率高达70%以上,对美罗培南和亚胺培南耐药率高于50%。耐药率较低的药物有多黏菌素B(10.53%,2/19)、阿米卡星(10.53%,2/19)、头孢他啶(15.79%,3/19)和庆大霉素(21.05%,4/19)。结论下呼吸道感染铜绿假单胞菌毒力基因exoS、exoU阳性率较高,以exoS+/exoU+基因型为主。与FQ-S比较,FQ-NS菌株耐药性更为严重,exoU阳性率更高,提示临床应加强毒力基因及耐药性监测。

慢性阻塞性肺疾病合并铜绿假单胞菌感染毒力基因与喹诺酮类药物的耐药性分析

目的通过研究慢性肺阻塞性疾病合并铜绿假单胞菌感染患者,多重耐药铜绿假单胞菌毒力基因exoU、exoS表达与喹诺酮类药物耐药性关系。方法收集我院2016年2月至2017年3月,已确诊为慢性肺阻塞性疾病患者453例,合并铜绿假单胞菌感染患者36例,发生铜绿假单胞菌多重耐药27例,对多重耐药菌株进行药物敏感实验与基因分析。结果在检出的27例铜绿假单胞菌多重耐药株,左氧氟沙星耐药为19株,占多重耐药株70.4%,携带exoU、exoS基因阳性率分别为79.0%(15例)、74.2%(14例),同时携带exoU、exoS基因68.3%(13例);环丙沙星耐药株17例,占多重耐药株63.0%,携带exoU、exoS基因阳性率分别为83.2%(14例)、73.1%(12例),同时携带exoU、exoS基因61.1%(10例)。结论慢性肺阻塞性疾病合并铜绿假单胞菌感染患者中,铜绿假单胞菌exoU基因和exoS基因,携带率高,同时携带exoU、exoS基因更容易发生耐喹诺酮类药物。

基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的铜绿假单胞菌快速检测方法的建立

目的 针对铜绿假单胞菌毒力基因exoS,建立一种实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)技术检测方法,并评价该方法的特异性、灵敏度及实用性。方法 根据铜绿假单胞菌毒力基因exoS的特异性保守区域,设计RPA特异性引物和探针,对提取的目标DNA进行检测,确定RPA方法的特异性和灵敏度;建立实时荧光定量PCR(qPCR)法,对目标DNA进行检测,比对不同检测方法对铜绿假单胞菌的检出限;通过临床样本性能验证试验,进一步确定RPA技术检测铜绿假单胞菌的可行性。结果 建立的RPA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有特异扩增曲线,对其他细菌无特异扩增曲线;RPA方法检测病原菌的灵敏度为5×10^(2) cfu/mL,该方法与qPCR法检出限一致且结果可靠;RPA方法检测时间仅需30 min,明显短于传统方法的检测时间。结论 该研究建立的铜绿假单胞菌RPA检测方法特异性强、灵敏度高,相对于传统检测方法明显缩短检测时间,可用于临床标本中铜绿假单胞菌的快速检测。

合肥地区铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统毒力基因检测分析

目的了解合肥地区铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)毒力基因ExoS和ExoU的携带情况及分布耐药特点。方法收集合肥地区2所三甲医院2013年1月-2015年1月临床分离的156株铜绿假单胞菌,使用VITEK-2Compact系统进行菌株鉴定和药敏试验,采用PCR法检测exoS、exoU毒力基因。结果 156株铜绿假单胞菌中有129株携带TTSS,其中exoU-/exoS+基因表型菌株为99株,占总阳性菌株76.7%,exoU+/exoS-基因表型菌株为21株,占总阳性菌株16.3%,exoU-/exoS-基因表型菌株为9株,占总阳性菌株6.98%;痰液标本和血液标本均以exoU-/exoS+基因表型最常见;药敏试验分析,TTSS阴性菌株对头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、亚胺培南、哌拉西林、环丙沙星的耐药性均高于TTSS阳性菌株(P<0.05);exoU-/exoS+菌株和exoU+/exoS-菌株的药敏试验结果相似。结论大多数铜绿假单胞菌中存在TTSS,且以exoU-/exoS+基因表型菌株为多;检测菌株exoU、exoS基因对临床诊断和抗菌药物合理运用有一定指导意义。

糖尿病足创面铜绿假单胞菌三型分泌系统和生物膜特点及与抗生素耐药性的关系

目的探讨糖尿病足(diabetic foot,DF)创面中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)三型分泌系统、生物膜特点,分析其与抗生素耐药性的关系。方法收集2018年2月1日至2018年12月31日天津医科大学朱宪彝纪念医院糖尿病足科住院DF患者创面中铜绿假单胞菌33株,作为DF组,同时收集非糖尿病创面中铜绿假单胞菌13株,作为对照组。做抗生素敏感试验,检测铜绿假单胞菌三型分泌系统毒力基因exoS、exoU及生物膜形成能力。分析其特点及与抗生素敏感性的关系和临床转归情况。结果两组均以携带exoS的铜绿假单胞菌为主。DF组占90.9%,对照组占84.6%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.54,P=0.46)。携带exoS的多重耐药菌株在DF组占16.7%,对照组占18.2%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.18,P=0.83)。携带exoU的铜绿假单胞菌共5株,DF组3株,1株多重耐药,对照组2株,无多重耐药株。DF组中生物膜增强的铜绿假单胞菌占57.6%,多重耐药株生物膜增强的占83.3%。两种铜绿假单胞菌产生的生物膜耐药性不同,但均对碳青霉烯类抗生素无效。产生生物膜的DF创面清创次数更多(P<0.01),抗生素使用时间更长(P<0.01),但愈合率在75%~90%。结论DF创面中以分泌exoS铜绿假单胞菌为主。DF创面中铜绿假单胞菌产生生物膜是其产生耐药的原因之一,通过多次清创联合敏感抗生素治疗是清除生物膜的有效方法。