不同信号肽对胞外β-(1,3)-葡聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:在胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽的N端添加不同类型的信号肽,研究不同信号肽对其在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响。方法:通过融合PCR方法将α成熟交配因子(MFα)、成熟交配因子Pre肽(αPre)和共翻译转运信号肽(Bip信号肽)等3种信号肽的DNA片段连接至胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽基因的5′端,利用PCR扩增包含其自身信号肽的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶基因,将上述4种基因片段分别插入pPIC9质粒,再转化巴斯德毕赤酵母GS115宿主菌并诱导表达;测定胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的活性,检测其表达水平。结果:目前在毕赤酵母中已广泛使用的MFα信号肽介导的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平最高,其次是αPre,Bip信号肽介导的该酶表达水平是酶自身信号肽介导的表达水平的2倍。结论:共转运信号肽能够提高胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的表达水平。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)外切葡聚糖酶CelB基因的发掘及功能鉴定

从地衣芽孢杆菌的基因组数据中寻找与外切葡聚糖酶相似性高的DNA序列,发现在地衣芽孢杆菌基因组中CelB DNA片段具有很高的序列相似性。在大肠杆菌中对来自地衣芽孢杆菌的CelB基因DNA片段进行表达并纯化蛋白质。CelB蛋白质对纤维素底物具有活性。根据糖基水解酶家族48的保守活性位点设计突变策略对CelB进行突变,突变体丧失对底物的活性,说明它具有糖基水解酶家族48的外切葡聚糖酶的典型活性位点。

福寿螺多功能纤维素酶(EGXA)的结构功能研究

利用点突变的方法构建了E332A、E332S和D290Q的多功能纤维素酶EGXA）的突变体，研究了在甲醇酵母中重组表达的突变体的酶学性质。结果表明：E332可能是该酶的活性必需基团，而D290Q突变体的外切葡聚糖酶及内切木聚糖酶活性均提高2～3倍，对EGXA研究及其应用提供了理论依据。

家蝇纤维素酶的检测及酶活性与其发育的关系

为了解家蝇能否降解利用纤维素,采用DNSA法检测家蝇幼虫纤维素酶活性及酶学特性;并进一步研究纤维素酶活性与家蝇发育的关系.结果显示,在生长发育的不同时期,家蝇都具有滤纸酶活性,活性范围为0.85(±0.035)IU mg-1至10.45(±0.050)IU mg-1;家蝇纤维素酶的组成包含3种酶,即β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)、内切β-1,4-葡聚糖酶(Endo-β-1,4 glucanase,EG)和外切β-1,4-葡聚糖酶(Exo-β-1,4-glucanase,CBH).在pH 5.6的条件下,这3种酶的最适反应温度和时间分别为50℃和60 min,在体外具有较强的热稳定性,50℃放置1 h后仍可保持较强的酶活性.纤维素酶活性随着家蝇的发育逐渐增高(P<0.05),卵的酶活性最低,成虫的酶活性最高,在最适反应条件下,成虫BG、EG和CBH的活性分别为(7.96±0.065)IU mg-1、(9.76±0.080)IU mg-1和(10.86±0.091)IU mg-1.这3种酶的活性在家蝇卵、幼虫、蛹和成虫4个发育阶段,均是CBH最高,BG最低.增加家蝇幼虫饲料中粗纤维的含量,3龄幼虫的纤维素酶活性明显提高(P<0.05),而平均体重和体长与对照组比无显著差异(P>0.05).研究表明家蝇具有完整的降解利用植物纤维素的酶系,其纤维素酶活水平与家蝇的发育密切相关.