重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测

目的:高效表达并纯化具有生物学活性的重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)-穿膜肽(tat)融合蛋白,为进一步开发基因工程药物提供实验依据。方法:通过双酶切方法,从质粒pMD18-T-aFGF-tat中获得aFGF-tat基因片段,并将aFGF-tat融合基因与原核表达载体pET3c连接后转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达,将融合蛋白经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化,MTT法检测aFGF-tat融合蛋白对NIH3T3细胞的促增殖作用。结果:经酶切和基因测序证实获得的重组人aFGF-tat基因序列与GenBank报道的完全一致,构建的pET3c-aFGF-tat表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达aFGF-tat融合蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符,经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化后蛋白纯度高于95%,Western blotting分析表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力,并能够促进NIH3T3细胞增殖。结论:成功表达重组人aFGF-tat融合蛋白工程菌,获得aFGF-tat纯蛋白,并证实aFGF-tat融合蛋白具有促细胞增殖活性。

成纤维细胞激活蛋白在大鼠烫伤创面修复过程中的动态表达

目的观测成纤维细胞激活蛋白(FAP)在大鼠不同深度烫伤创面修复过程中的动态表达特点。方法制作大鼠浅Ⅱ°和深Ⅱ°两组烫伤模型(每组42只),每组在伤后6、12 h,1、3、7、14、21 d各处死6只大鼠,另设6只正常大鼠皮肤作为对照。免疫组织化学和免疫印迹技术观测创面组织FAP的含量。结果 FAP在创面成纤维细胞的细胞膜和细胞质表达,尤其是创面新生血管周围。烫伤后6 h FAP表达明显增多。浅Ⅱ°创面6 h与12 h,1 d与3 d比较,FAP的表达差异无统计学意义(P>0.05),余各时间点与相邻时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。深Ⅱ°创面12 h与1 d,1 d和3 d比较,FAP的表达差异无统计学意义(P>0.05),余各时间点与相邻时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。两组创面FAP表达的高峰均出现在烫伤后第7天,之后逐渐下降,至伤后第21天FAP的表达量仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FAP的动态表达特点提示它在创面修复过程中起重要作用。

PAK6、p53在膀胱癌中的表达及其临床意义

目的探讨P21活化激酶6(p21-activated kinase 6,PAK6)以及p53在膀胱癌中的表达及其临床意义。方法取膀胱癌患者85例作为膀胱癌组,并取其膀胱癌组织;取行膀胱部分切除或全部切除术患者35例为对照组,取其正常膀胱上皮组织。采用免疫组织化学法检测2组组织PAK6、p53蛋白阳性表达率。Biu-87组、T24组膀胱癌细胞和SV-HUC-1正常膀胱细胞分为Biu-87组、T24组和SV-HUC-1组,采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞的PAK6、p53 mRNA表达水平。结果膀胱癌组PAK6蛋白阳性表达率低于对照组(P<0.05),膀胱癌组复发者PAK6蛋白阳性表达率低于原发者(P<0.05)。膀胱癌组PAK6蛋白阳性表达率在肿瘤数量、是否转移、病理分级以及临床分期上差异无统计学意义(P>0.05)。Biu-87组、T24组细胞PAK6 mRNA表达水平均低于SV-HUC-1组(P<0.05)。Biu-87组、T24组细胞p53 mRNA表达水平均高于SV-HUC-1组(P<0.05)。结论PAK6在膀胱癌细胞中以及膀胱癌组织中低表达,并且与膀胱癌的复发有着密切的联系,在膀胱癌发生发展中有抑制作用,PAK6可能会作为新的抑癌指标用以指导临床。p53在膀胱癌细胞与膀胱癌组织中高表达,与病理分级、临床分期等密切相关,具有评估膀胱癌预后的价值。

成纤维细胞活化蛋白在瘢痕疙瘩组织中的表达及意义

目的:了解成纤维细胞活化蛋白(FAP)在瘢痕疙瘩组织中的表达情况,探讨FAP在瘢痕疙瘩发病机制中的作用。方法:采用免疫组化染色技术检测30例瘢痕疙瘩组织(病例组)和20例正常皮肤组织(对照组)中FAP的表达强度,并比较两组间及瘢痕疙瘩不同临床分级之间FAP表达阳性率的差异。结果:病例组瘢痕疙瘩组织中FAP在成纤维细胞和血管内皮细胞内表达,阳性率为73.33%;对照组正常皮肤组织中未见FAP表达,两组间FAP表达阳性率比较,差异有统计学意义(x^2=26.19,P=0.001);瘢痕疙瘩临床分级中,轻度与重度之间及中度与重度之间比较,FAP表达阳性率差异均有统计学意义(P值分别为0.002、0.006)。结论:瘢痕疙瘩组织中FAP表达阳性率明显高于正常皮肤组织;瘢痕疙瘩临床分级越严重,FAP表达阳性率越高;FAP可能参与瘢痕疙瘩的发病机制,针对FAP的干预可能有助于瘢痕疙瘩的治疗。

稳定过表达成纤维细胞激活蛋白的口腔鳞状细胞癌细胞株的构建

目的构建人成纤维细胞激活蛋白(FAP)过表达慢病毒载体,转染口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞株SCC9,构建稳定过表达FAP的OSCC细胞株。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术获得FAP片段,利用基因重组技术构建过表达FAP的慢病毒载体,包埋病毒并收集上清液感染SCC9细胞株,通过流式细胞荧光分选技术(FACS)进行筛选,获得稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结果对阳性克隆进行酶切鉴定和基因测序证明FAP的慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果证明成功构建稳定过表达FAP的SCC9细胞株。结论本研究有助于获得纯化FAP蛋白,为进一步研究FAP在OSCC发生发展过程中的机制奠定基础。

成纤维细胞激活蛋白及其突变体真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（FAPα）真核表达质粒pc DNA-w FAPα（野生型FAPα）、pc DNA-t FAPα（胞外段FAPα）和pc DNA-m FAPα（缺失624~704位氨基酸的突变型FAPα）。方法 以口腔癌组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增w FAPαc DNA基因片段,连接至真核表达质粒pc DNA3.1（＋）获得重组pc DNA-w FAPα质粒。以重组pc DNA-w FAPα为模板,扩增t FAPα基因片段;用overlap PCR技术,获得m FAPα基因;分别连接至pc DNA3.1（＋）获得重组pc DNA-t FAPα和pc DNA-m FAPα质粒。结果 酶切鉴定和测序验证皆显示pc DNA-w FAPα、pc DNA-t FAPα和pc DNA-m FAPα为正确重组质粒。结论 成功构建人野生型FAPα（w FAPα）、胞外段FAPα（t FAPα）和突变型FAPα（m FAPα）真核表达质粒,为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。

小鼠成纤维细胞激活蛋白α二肽基肽酶核心序列原核表达与纯化及复性

目的:构建小鼠成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)二肽基肽酶催化核心序列(FAPαc)的高效原核表达载体,进行该序列的原核表达、纯化和复性,为下一步高效抗体制作和以FAPα为靶标的抗肿瘤疫苗研发提供实验基础。方法:用PCR技术,从质粒pSecTag2/Hy-groB-FAPα中扩增出编码FAPα二肽基肽酶催化核心区域的基因片段,与原核表达载体pET28α(+)连接,在BL21(DE3)工程菌中实现重组蛋白His6-FAPαc的表达,并进行纯化和复性。结果:成功构建了小鼠来源的FAPα二肽基肽酶催化核心区域的原核表达质粒,通过对转化该质粒后的感受态细菌进行菌液PCR鉴定以及对该质粒进行BamHI和XhoI双酶切鉴定,鉴定结果与预期结果完全一致;实现了对该质粒编码的融合蛋白His6-FAPαc的表达,表达后的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,表达产量占菌体总蛋白>70%;纯化了该融合蛋白,纯化后的蛋白纯度通过灰度分析>99%;对该融合蛋白进行了复性,复性后该融合蛋白由不溶的包涵体状态变为可溶的水溶状态。结论:成功表达、纯化和复性了FAPα二肽酶催化核心区域FAPαc,为深入开展FAPα的研究奠定基础。

小鼠成纤维活化蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠成纤维活化蛋白（FAP）基因的真核表达载体，并检测其在人胚肾细胞及小鼠体内的表达。方法根据GeneBank中mFAP基因（NM_007986）全序列设计聚合酶链反应（PCR）引物，获得其开放式阅读框（ORF）。将目的基因片段克隆至真核表达载体pcDNA6／myc—His—B，转化并筛选。将重组质粒注射入小鼠尾静脉，在注射后1、3、5、7d抽提小鼠腓肠肌组织的总RNA，检测FAP表达。结果经过酶切鉴定、测序比对，确定所筛选的阳性克隆为pcDNA6-mFAP重组子，其可在真核细胞及小鼠体内正常表达，并产生相应蛋白质产物。在小鼠体内注射后第5天，重组子的基因（0．841±0．040）和蛋白表达量（85．380±4．425）％最高，和空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论成功构建FAP真核表达载体，为研究该基因产物的功能和进行疫苗抗肿瘤实验提供基础。

富含T细胞表位的肿瘤成纤维细胞激活蛋白片段克隆表达及纯化

目的：表达并纯化富含T细胞表位的肿瘤成纤维细胞激活蛋白（fibroblas tactivation protein，FAP）片段。方法：利用T细胞表位预测软件及酶切位点预测软件分析FAP全长，选取FAP蛋白内富含T细胞表位又缺少酶切位点的多肽AA264～AA449（NP-032012．1）作为目的表达片段。该多肽所对应的核酸片段为mRNA798～1418（GenBank：BC019190．1）。利用PCR技术从含有FAP基因全长的质粒pCDNA3．1-FAP中扩增目的基因mRNA798～1418，并将该基因与原核表达载体pET-28a（＋）连接，在BL21工程菌中实现重组蛋白His6-FAP的表达，并利用His标签进行纯化。结果：成功构建了富含T细胞表位的FAP原核表达质粒pET-28a（＋）-FAP对该质粒进行BamHl／Xhol双酶切鉴定，鉴定结果与预期完全一致；实现了对该质粒编码的融合蛋白His6-FAP2的表达，表达后的融合蛋白主要以包涵体的形式存在；利用His标签纯化了该融合蛋白，纯化后灰度分析其纯度达95％。结论：成功表达并纯化了富舍细胞表位的FAP片段，为下一步以FAP为靶标的肿瘤免疫治疗策略提供了实验基础。

成纤维激活蛋白α在不同实体瘤组织的表达及其与病理分级和淋巴结转移的相关性

目的观察人实体瘤组织成纤维激活蛋白α(FAPα)蛋白表达与肿瘤发生发展的关系。方法收集55例经手术切除的不同来源实体瘤组织和10例良性肿瘤组织病理标本,用免疫组织化学方法检测其中FAPα的表达,分析其与临床病例参数的关系并比较2种肿瘤组织的差异。结果实体瘤组织与良性肿瘤的FAPα表达率差异有统计学意义(P<0.001);组织中有无淋巴结转移对FAPα强阳性表达差异有统计学意义(P<0.05);病理分级的级别越高,肿瘤组织中FAPα的表达越强(I级vs IV级,P<0.05);不同临床分期的肿瘤组织中FAPα表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 FAPα在乳腺癌等多种实体瘤组织中存在阳性表达,且其表达水平与病例的病理分级及淋巴结转移密切相关。