不同诱导培养条件对重组绵羊β_2-AR第二细胞外环在大肠杆菌中表达的影响

【目的和方法】研究对不同诱导时间、诱导剂IPTG终浓度、培养温度和振荡培养箱转速等4个诱导培养条件对绵羊β2-肾上腺素能受体（β2-adrenoceptor,β2-AR）第二细胞外环重组质粒pET32C-AR/Se在大肠杆菌BL21（DE3）中表达水平的影响进行了研究,以筛选其最佳培养条件。【结果】随着IPTG诱导时间的延长,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量逐渐增加,在2 h时相对表达量达到最大值,为菌体总蛋白的30.1%。IPTG终浓度在0.01~2 mmol/L时,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量水平均在27%~30%;当IPTG终浓度为0.01 mmol/L时,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的30.5%。在设置的4个诱导温度中,25℃时重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的35.5%。在振荡培养箱不同转速条件下,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量在33%~40%波动;在200 r/min时,相对表达水平最高,为细菌总蛋白的40.0%。【结论】绵羊β2-AR第二细胞外环基因在大肠杆菌中的表达最佳条件为：重组菌株在LB液体培养基中生长至OD6000.5左右时,加入IPTG至终浓度0.01mmol/L,于25℃、200 r/min诱导120 min。

闭合蛋白的胞外环缺失对小鼠TM4细胞紧密连接的影响分析

目的:分析闭合蛋白的2个胞外环结构域在小鼠TM4细胞紧密连接中的功能。方法:利用基因工程的方法,分别或者同时缺失掉闭合蛋白的2个胞外环,将缺失了胞外环3个闭合蛋白基因序列,分别克隆入pcDNA3.1表达载体,再转入TM4细胞。用RT-PCR和Western印迹分析闭合蛋白表达量,用紧密连接的体外细胞模型来分析闭合蛋白的胞外环对紧密连接程度的影响。结果:测序结果表明pcDNA3.1-occludinΔOCC1、pcDNA3.1-occludinΔOCC2和pcDNA3.1-occludinΔOCC1+OCC2表达载体已经构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示3个缺失组闭合蛋白的mRNA和蛋白质的表达量都显著高于对照组。体外紧密连接模型分析结果表明闭合蛋白2个胞外环都能够增加TM4的紧密连接程度,其中,pcDNA3.1-occludinΔOCC1转染组每天的大分子通过率均比pcDNA3.1-occludinΔOCC2转染组显著降低(P<0.05),表明闭合蛋白第二个胞外环对紧密连接的影响程度比第一个胞外环要高。结论:闭合蛋白2个胞外环都能够影响小鼠TM4细胞紧密连接的程度,并且第二个胞外环对紧密连接的影响程度比第一个胞外环要高。

β1-AA下调脂联素水平诱发糖尿病的机制研究

目的探讨脂联素水平在β1-肾上腺素受体自身抗体(autoantibodies against the second extra-cellular loop of theβ1-adrenoceptor,β1-AA)诱导糖尿病发生发展中的作用。方法收集45例诊断糖尿病患者和42例健康体检者的血清,ELISA法检测血清中β1-AA及脂联素水平;建立β1-AA主动免疫小鼠模型,动态检测小鼠血糖变化;标记法芯片技术筛选主动免疫模型小鼠外周血清中发生改变的细胞因子,进一步从大体及细胞水平进行验证。结果与健康体检者相比,糖尿病患者血清β1-AA效价及阳性率均增高[(0.82±0.31)vs.(0.12±0.10),57.7%vs.0.1%,P<0.001],脂联素水平降低[(0.19±0.09)vs.(1.08±0.62),P<0.001];主动免疫8周时,免疫组小鼠空腹血糖明显高于对照组[(14.0±0.81)mmol/L vs.(5.03±0.21)mmol/L,P<0.001)],且空腹葡萄糖耐量试验呈阳性;芯片结果显示,主动免疫8周时,小鼠外周血清中脂联素水平显著低于对照组(变化比值>100);蛋白免疫印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应显示,主动免疫8周脂肪组织脂联素蛋白及mRNA水平均低于对照组;细胞实验发现,β1-AA刺激后,3T3-L1细胞脂联素分泌减少。结论脂联素在β1-AA诱导的糖尿病发生发挥重要作用。

调控骨髓间充质干细胞成骨分化的Wnt/β-catenin信号通路及相关因素

背景:骨髓间充质干细胞诱导成骨而抑制成脂分化是骨质疏松症防治的关键,也是骨组织修复工程种子细胞的来源,Wnt信号通路对骨形成起着重要作用。目的:综述Wnt/β-catenin信号通路调控骨髓间充质干细胞成骨分化的相关因素及分子机制。方法:应用计算机检索CNKI、PubMed及万方医学数据库建库至2020年2月发表的相关文献,中文关键词为"骨髓间充质干细胞,骨质疏松,成骨分化,骨细胞,细胞外基质,骨关节炎,Wnt,β-catenin",英文关键词为"BMSCs,osteoarthritis,Wnt/β-catenin,Wnt",最终纳入62篇符合标准的文献进行综述。结果与结论:通过Wnt/β-catenin关键信号通路作用的各种因素可以直接或间接促进骨髓间充质干细胞成骨分化,有正向促进,也有反向抑制甚至由于各因素之间相互作用形成环路调控。Wnt/β-catenin信号通路是骨髓间充质干细胞成骨分化的关键信号通路;通过系统分析骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制为骨组织工程研究提供理论基础,可以更快实现骨组织工程治疗应用。

Claudin-1胞外片段Cldn-1 50～80的作用在乳腺癌转移机制中的研究

目的观察Claudin-1在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系，探讨Claudin－1的胞外区Cldn-1 50～80片段在乳腺癌转移中的作用机制。方法（1）应用免疫组织化学技术检测108例乳腺癌标本中Claudin-1的表达情况，并分析其与乳腺癌淋巴结转移、TNM分期和分子分型间的关系；（2）在乳腺癌细胞株中掺入Cldn-1 50～80片段，应用Western blot技术检测紧密连接蛋白Claudiml、Claudin-2的表达。结果（1）以是否淋巴结转移、临床分期、分子分型等病理特征为依据分组中，Claudin-1的表达强度在淋巴结转移组（χ^2=6．279，P=0．012）、TNM分期Ⅲ、Ⅳ期（χ^2=7．419，P=0．024）及分子分型为Her-2过表达型（χ^2=10．830，P=0．013）组中显著降低，差异有统计学意义；（2）Cldn-1 50～80片段的掺入可导致乳腺癌细胞中紧密连接蛋白Claudin-1及Claudin-2的表达下降，在转移性高的乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，这种抑制作用更为显著。结论紧密连接蛋白Claudin-1的表达降低与乳腺癌的进展和转移密切相关，而Cldn-1 50～80片段通过调控紧密连接蛋白的表达在乳腺癌细胞侵袭、转移过程中发挥重要作用。

毛细管区带电泳研究化合物S009和CC趋化因子受体4三个胞外区相互作用（英文）

CC趋化因子受体4(CCR4)是G蛋白偶联受体的一种,在过敏性炎症中起着举足轻重的作用。在本研究中,我们合成了CCR4的三个胞外loop区(EL1–EL3),用毛细管区带电泳(CZE)的方法研究化合物S009和3个胞外loop区的相互作用。分别进行了定性和定量研究。实验数据表明,化合物S009和EL3有相互作用并通过Scatchard方程计算得到化合物S009和EL3之间的结合常数为(12.5±0.19)×104 M–1。我们的研究确证了CCR4结合小分子的具体胞外域并为进一步发现新型CCR4拮抗剂提供了有帮助的信息。

抗人Kv1.5胞外环肽段E215抗体的制备与鉴定

目的:为研究新的人Kv1.5(hKv1.5)通道/超快激活延迟整流钾通道(Ikur)阻滞剂,通过免疫法制备抗hKv1.5胞外环肽段E215的特异性抗体,并进行鉴定。方法:雄性新西兰大白兔,随机分为免疫组和假性免疫组。从hKv1.5胞外环中筛选出一段短肽E215作为抗原肽免疫动物。免疫组予抗原免疫,2周1次,假性免疫组予0.9%氯化钠溶液免疫,方法同前。实验63 d处死,留取血清,亲合层析法提取、纯化抗肽段E215抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)动态地观察抗体在体内的产生及效价,免疫荧光组织化学及免疫印迹(Western-blot)观察制备的抗体与人心房肌细胞膜及hKv1.5/Ikur通道蛋白的结合。结果:ELISA结果表明,免疫组于实验第28、42、56、63 d血清抗体滴度分别达到1∶6 400、1∶6 400、1∶6 400、1∶12 800;免疫荧光组织化学显示,制备的抗体能结合于人心房肌细胞的细胞膜;Western-blot结果表明,此抗体能特异性结合人心房肌细胞膜上分子量为75000的蛋白(hKv1.5/Ikur通道蛋白)。而假性免疫组未发现相同抗体产生。结论:所制备胞外环肽段E215的抗体能与人心房肌细胞膜上hKv1.5/Ikur通道特异性结合,为下一步实验提供了新的药理学干预手段。