转录后调控元件部分或完全缺失对乙型肝炎病毒前基因组RNA核外输出的影响

目的探讨转录后调控元件(post-transcriptional regulatory element,PRE)部分或完全缺失对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)核外输出的影响。方法以含HBV全基因组质粒为模板,采用PCR法构建PRE完全缺失质粒(HBVΔPRE)、PREα缺失质粒(HBVΔPREα)、PREβ缺失质粒(HBVΔPREβ)、SLα缺失质粒(HBVΔSLα)、SLβ缺失质粒(HBVΔSLβ)。对数生长期人肝癌HepG2细胞分为WT组(转染HBV全基因组质粒)、del-PREα组(转染HBVΔPREα)、del-PREβ组(转染HBVΔPREβ)、del-PRE组(转染HBVΔPRE),转染48h后采用反转录实时荧光定量PCR法检测4组细胞、细胞质、细胞核HBV pgRNA相对表达量,计算细胞质与细胞核HBV pgRNA比值(细胞质/细胞核HBV pgRNA);采用Western blot法检测WT组与del-PRE组细胞乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)蛋白相对表达量。对数生长期HepG2细胞分为WT组(转染HBV全基因组质粒)、del-SLα组(转染HBVΔSLα)、del-SLβ组(转染HBVΔSLβ),转染48h后采用反转录实时荧光定量PCR法检测3组细胞、细胞质、细胞核HBV pgRNA相对表达量,计算细胞质/细胞核HBV pgRNA。结果WT组细胞、细胞质HBV pgRNA相对表达量(1.03±0.07、1.01±0.21)及细胞质/细胞核HBV pgRNA(1.01±0.01)均高于del-PREα组(0.74±0.04、0.57±0.01、0.41±0.00)、del-PREβ组(0.58±0.02、0.24±0.01、0.30±0.01)、del-PRE组(0.41±0.01、0.21±0.00、0.30±0.00)(P<0.05),del-PREα组均高于del-PREβ组、del-PRE组(P<0.05);del-PREβ组细胞、细胞质HBV pgRNA相对表达量均高于del-PRE组(P<0.05),细胞质/细胞核HBV pgRNA与del-PRE组比较差异无统计学意义(P>0.05)。del-PREα组细胞核HBV pgRNA相对表达量(1.38±0.01)均高于WT组(1.00±0.02)、del-PREβ组(0.79±0.01)、del-PRE组(0.71±0.01)(P<0.05),WT组均高于del-PREβ组、del-PRE组(P<0.05),del-PREβ组高于del-PRE组(P<0.05)。del-PRE组HBsAg蛋白相对表达量(0.66±0.00)低于WT组(1.01±0.01)(t=70.136,P<0.001),HBcAg蛋白相对表达量(1.25±0.06)高于WT组(1.00±0.06)(t=—6.378,P=0.023)。del-SLα组细胞、细胞核HBV pgRNA相对表达量(1.47±0.01、1.84±0.02)均高于WT组(1.04±0.07、1.01±0.02)、del-SLβ组(0.74±0.01、0.87±0.03)(P<0.05),WT组均高于del-SLβ组(P<0.05);WT组细胞质HBV pgRNA相对表达量(1.01±0.02)、细胞质/细胞核HBV pgRNA(1.00±0.01)均高于del-SLα组(0.95±0.00、0.52±0.01)、del-SLβ组(0.76±0.01、0.87±0.03)(P<0.05),del-SLα组细胞质HBV pgRNA相对表达量高于del-SLβ组(P<0.05),细胞质/细胞核HBV pgRNA低于del-SLβ组(P<0.05)。结论HepG2细胞PRE部分或完全缺失可抑制HBV pgRNA合成及核外输出,茎环结构SLα、SLβ缺失突变可抑制HBV pgRNA核外输出。