实时定量RT-PCR对乙型肝炎病毒全长RNA(fRNA)的定量检测

目的:建立一种简便的定量检测慢性乙型肝炎患者血清中终止于聚腺苷酸化位点的乙型肝炎病毒全长RNA(f RNA)的方法。方法:选取53例未治疗的乙型肝炎患者及22例HBs Ag阴性的健康者为研究对象,使用锚定oligo-d T的引物对其血清中f RNA进行实时定量反转录PCR检测,统计分析其与HBV DNA、HBcr Ag和HBe Ag的相关性。结果:对f RNA进行实时荧光定量RT-PCR检测的下线为2.3 log copies/ml,标准曲线的相关系数为0.99(P<0.0001)。53例乙型肝炎患者中,29例(54.7%)可以检测到f RNA,22例正常对照中没有检测到f RNA。27例HBe Ag阳性和/或高水平HBV DNA的患者全部检测到f RNA,26例HBe Ag阴性并且低水平HBV DNA的乙型肝炎患者中有2例(7.7%)检测到f RNA(P<0.0001)。HBe Ag阳性患者血清中f RNA水平高于HBe Ag阴性患者(5.0±0.3 vs.2.9±0.4 log copies/ml,P<0.001)。f RNA与HBV DNA/HBcr Ag具有显著相关性(r=0.905、0.881,P<0.0001)。Hayashi's定量分析法I显示f RNA与HBV DNA相关性强于其与HBcr Ag的相关性。结论:与HBV DNA和HBe Ag一样,f RNA可作为常规检测判断HBV的复制水平并指导用药。

游泳池水中FRNA噬菌体检测初探

目的探讨FRNA噬菌体在本市游泳池水中的分布规律,预测肠道病毒污染的可能性和严重性,为水质消毒处理提供依据。方法参照美国公共卫生署(APHA)标准方法9224E,建立水样MS-2噬菌体的检测方法,应用于20份游泳池水样的检测,同时进行水样大肠菌群、游离性余氯检测。结果 20份游泳池水样中有5份检出MS-2噬菌体,最高值为9 PFU/100 ml,最低值为1 PFU/100 ml。4份大肠菌群阳性水样中有3份检出MS-2噬菌体,另有2份大肠菌群阴性水样中检出MS-2噬菌体。检出MS-2噬菌体的水样游离性余氯值均未达标。结论游泳场馆水体有被肠道病毒污染的风险,有必要引入FRNA噬菌体检测以有效指示和预测肠道病毒的污染。规范监测和调整游泳池水氯消毒水平,对水中大肠菌群和肠道病毒的抑制和消除具有重要作用。

乙型肝炎病毒转录体的检测及与隐源性肝病的研究

目的:探讨不同肝病患者血清中乙型肝炎病毒转录体的表达及与隐匿性感染的关系。方法:用血清核酸提取试剂盒从不同肝病患者血清中提取核酸,PCR及RT-PCR扩增HBVxDNA、fRNA和trRNA,琼脂糖电泳及Southern杂交验证显示结果。结果:HBVxDNA和fRNA在HBsAg(+)血清中检出率显著高于HBsAg(-)者,(P<0.05)。trRNA在HBsAg(+)血清中检出率和HBsAg(-)者无显著差异,(P>0.05)。trRNA在HBsAg(-)的肝癌、肝硬化血清中有高检出率,分别为66.7%、70.0%。此外,在丙肝和其他肝病中trRNA的检出率比HBVxDNA和fRNA的检出率高。结论:HBV病毒转录体与隐匿性感染密切相关。trRNA是某些HBsAg(-)肝病HBV感染的唯一指标,这将为把trRNA作为诊断特殊HBV感染的诊断标志物打下基础。

新生儿trRNA独立阳性的HBV感染状态

目的:探讨新生儿trRNA独立阳性的HBV感染状态的稳定性及影响因素.方法:跟踪随访85例HBsAg阳性孕妇及所生新生儿,孕妇在接受HBIG治疗前和分娩前各采血1次,新生儿在出生后24h内、1、3、6、9、12、18、24mo各采血1次,检测trRNA、fRNA、乙型肝炎五项和HBVDNA定量,按新生儿trRNA分组比较新生儿HBV活动性感染的发生率,按母亲HBIG治疗、HBeAg、HBV-DNA定量分别分组比较母婴trRNA、fRNA的检出率.结果:随访的新生儿无HBV活动性感染发生,新生儿fRNA均阴性.分别以母婴是否行HBIG治疗分组,比较新生儿trRNA检出率,差别均无统计学意义;以母亲HBeAg分组,分别比较母婴trRNA检出率,差别无统计学意义,而母亲fRNA检出率差别有统计学意义(χ2=8.119,P=0.004);以孕妇产前HBVDNA定量分组,同样分别比较母婴trRNA检出率,差别无统计学意义,而母亲fRNA的检出率差别有统计学意义(χ2=21.948,P=0.000).结论:在随访的近2年时间内,新生儿trRNA独立阳性的HBV感染状态是稳定的,trRNA的检出不受母婴是否行HBIG治疗、HbeAg及HBV-DNA定量的影响.

血清中乙型肝炎病毒转录的检测在母婴垂直传播中的临床意义

目的探究血清中乙型肝炎病毒转录的检测在母婴垂直传播中的临床意义。方法选择解放军第三〇二医院2014年10月~2016年10月收治的HBV表面抗原(HBs Ag)为阳性的40例产妇及其新生儿作为研究对象,按照HBe Ag阴性/阳性分为HBe Ag阳性组(21例)和HBe Ag阴性组(19例),分别抽取2 m L母亲外周血和新生儿脐静脉血,提取RNA,经过逆转录及RT-PCR扩增,得到乙肝病毒DNA(HBx DNA),全长型病毒转录体(f RNA),顿挫型病毒转录体(tr RNA),利用琼脂糖凝胶电泳显示出产物。结果 HBe Ag阳性组中母体HBx DNA阳性率和f RNA阳性率明显高于HBe Ag阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。根据母体HBx DNA表型分为HBx DNA阳性组和HBx DNA阴性组。HBx DNA阳性组中母体f RNA阳性率、tr RNA阳性率和新生儿tr RNA阳性率高于HBx DNA阴性组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论与f RNA、HBx DNA相比,tr RNA更早出现在HBV母婴传播过程中,有利于确定新生儿HBV感染情况,具有一定的辅助诊断价值。

miR-21和PDCD4mRNA在大肠癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨miR-21和PDCD4mRNA在大肠癌组织中的表达及与其临床病理特征的关系,并阐明在大肠癌活体组织中miR-21与其靶基因PDCD4表达的关系.方法 用荧光定量PCR技术检测43对大肠癌组织及其对应的正常黏膜组织中的miR-21和PDCD4 mRNA表达量；免疫组化SP法检测PDCD4蛋白的表达.结果 大肠癌组织中miR-21的表达升高（P＜0.05）,而PDCD4mRNA的表达降低（P＜0.05）.miR-21的表达与大肠癌的淋巴结转移、临床分期（Ⅰ＋Ⅱ、Ⅲ＋Ⅳ）有关（P＜0.05）,而与患者的性别、肿瘤位置、肿瘤大小、浸润深度、远处转移、临床分期（Ⅰ、Ⅱ）无关（P＞0.05）；PDCD4mRNA的表达与大肠癌的浸润深度、临床分期（Ⅰ、Ⅱ）有关（P＜0.05）,而与患者的性别、肿瘤位置、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、临床分期（Ⅰ＋Ⅱ、Ⅲ＋Ⅳ）无关（P＞0.05）.miR-21的表达与PDCD4蛋白的核表达、核与浆表达之和存在负相关（P＜0.05）,而与PDCD4mRNA、PDCD4蛋白的浆表达无相关性（P＞0.05）.结论 miR-21和PDCD4mRNA在大肠癌中的异常表达与大肠癌的预后有关；在大肠癌活体组织中,miR-21通过与PDCD4mRNA的3’非编码区结合抑制PDCD4mRNA翻译成蛋白质.

PCR在HBV核酸定量检测中的应用

目的:探索一种简便定量分析系统,通过检测HBV携带者血清中的HBV X区DNA,fRNA和trRNA拷贝数,为提高隐匿性感染期低复制状态HBV检测效果提供可能。方法:从血清中提取HBV DNA和RNA,对Core区、X区DNA进行PCR扩增,使用半巢式PCR法对fRNA、trRNA在同一离心管中进行反转录并扩增,选取大小相近的质粒作为竞争模板对其进行定量。并对拉米夫定干预治疗14周前后的患者血清中HBV XDNA、Core DNA、fRNA和trRNA拷贝数进行检测与比较。所有检测结果均通过southern杂交进行验证。结果:建立了针对DNA的定量分析系统及针对RNA的RT-PCR定量分析系统,并且阐明了阿米夫定治疗前后HBV DNA和X区RNA结构和数量的变化。治疗前治疗后DNA和RNA的拷贝数均下降。Core DNA下降显著,为103-104倍,而XDNA拷贝数下降102倍。而fRNA和trRNA仅有小幅下降,为10倍左右。结论:可以通过竞争性PCR方法对血清中HBV DNA和RNA进行定量检测,以期为HBV病毒的诊断提供更充足依据。