适应性进化技术选育优良乙醇耐受性能Millerozyma farinosa

为提高白酒品质,以筛选自特香型白酒酒醅中的菌株Millerozyma farinosa NCUF 304.1为原始菌株,进行乙醇耐受适应性进化研究,获得1株高乙醇耐受性菌株M.farinosa NCUF 304.1-1(最高可耐受13%乙醇体积分数)。分析8%乙醇对出发菌株和进化菌株的生长情况、细胞膜及其细胞表面结构的影响。结果表明,相比原始菌株,在8%乙醇的胁迫下,M.farinosa NCUF 304.1-1的生长延滞期明显缩短,生物积累量显著增加,细胞内泄漏物含量明显减少,且其细胞膜和细胞表面结构完整性提高。另一方面,M.farinosa NCUF 304.1-1细胞内丙二醛含量显著降低19.5%,抵抗氧化损伤能力明显增加。这表明M.farinosa NCUF 304.1-1是1株既具有高乙醇耐受性又具备较高抗损伤能力的菌株。这一性质有助于提高M.farinosa应用于酒类酿造降解生物胺,对提高酒的品质及质量安全具有积极意义。

粉棒束孢Isaria farinosa的研发进展

粉棒束孢Isaria farinosa是一种常见的昆虫病原真菌,已被用作一种生物因子防治温带农林害虫、植物病原和线虫。同时,粉棒束孢作为冬虫夏草中的定殖真菌,严重危害冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis寄主蝙蝠蛾幼虫的饲养,引起了资源昆虫研究者的高度重视和控制。作为生防真菌,粉棒束孢资源的分布和筛选、分子鉴定和遗传多样性、培养、活性成分和药效、分子生物学、害虫生物防治、病害控制、安全性等是学术界的研究重点;作为冬虫夏草寄主昆虫病原菌,学界和产业界一直研究其感染特征、侵染机理和防霉剂筛选等,为这一真菌的高效安全控制提供基础。本文将综述粉棒束孢在利用和控制两大方面的研发进展。

虫花Isaria farinosa04-1产糖条件优化及其胞外多糖活性研究

以菌丝体量和胞外多糖(EPS)含量为衡量指标,通过单因素和正交试验对虫花Isaria farinosa 04-1的培养条件进行优化,确定了液态发酵的适宜条件为:蔗糖2.5%、牛肉膏0.8%、初始p H 4.0、温度28℃,优化后的菌丝体量和EPS含量分别比优化前提高了13.05%和37.66%。胞外多糖活性研究表明,EPS具有与透明质酸相当的吸湿保湿能力;能很好地清除羟自由基,EC50值可达1.285 mg/m L。此外,虫花EPS还具有良好的螯合铁离子能力,EC50值为2.606 mg/m L。

侵染松墨天牛幼虫的虫生真菌鉴定及致病性测定

从自然罹病的1头松墨天牛Monochamus alternatus幼虫僵虫中分离纯化得到1株虫生真菌MX-04。采用形态学和分子生物学相结合的方法对其进行鉴定,测定其生物学特性及其对松墨天牛幼虫的致病性。结果表明:菌株MX-04为粉质虫草Cordyceps farinosa,在25℃下培养14 d后产孢量为(8.39±1.03)×10^(7)个/cm^(2);菌株MX-04对松墨天牛幼虫具有较高的致病力,松墨天牛3龄幼虫接种13 d后死亡率达86.67%,LT_(50)值为6.80 d。菌株MX-04具有开发为松墨天牛生防制剂的良好潜力。

粉状毕赤酵母NGH的氨氮降解特性及除氨效果研究

从鸡粪中分离筛选出一株具有氨氮去除能力的菌株,经形态学观察、分子生物学方法和生物化学法鉴定,表明菌株为粉状毕赤酵母(Pichia farinosa),命名为Pichia farinose NGH。通过调整培养条件,研究菌株的最佳生长温度、pH,最佳降解碳源、C/N,以及菌株对不同初始氨氮浓度的耐受性。结果表明:菌株NGH可在20~35℃、pH为3~7条件下生长良好,当碳源为葡萄糖、碳氮质量比为20时氨氮降解效果最佳。菌株NGH对高浓度的氨氮具有很强的耐受性,能够耐受浓度范围为100~1 200mg/L的氨氮。将菌株NGH的菌悬液接种于肉鸡粪便后,可抑制鸡粪氨气的排放,最高抑制率可达到25.52%。表明菌株NGH在污水处理、控制粪便氨气排放等领域具有一定的应用潜力。

土壤微生态环境对冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫病原菌粉棒束孢宿存及毒力的影响研究

测定了温度、含水量、土壤微生物三个因素以探讨蝙蝠蛾幼虫生长过程中微生态环境对粉棒束孢(Isaria farinose)宿存及毒力的影响。结果表明粉棒束孢30℃保存6个月的宿存量降低至10^3个/g以下。随着保存温度降低,宿存量的下降速度变缓,粉棒束孢在-18℃保存1年后,宿存量仍基本维持在10^6个/g以上。粉棒束孢在低湿环境下(含水量<35%)保存1年的宿存量维持在10^4个/g,含水量45%~65%,粉棒束孢宿存量会先增加后降低,降低的速度基本随湿度的增加而增加,1年后宿存量降低至10^3个/g以下。土壤微生物对粉棒束孢的宿存具有明显抑制作用,野外高山草甸土壤中微生物显著抑制粉棒束孢萌发,不利于粉棒束孢的宿存,而室内饲养土壤由于幼虫排泄物、饲料腐殖质可能有利于粉棒束孢的宿存。上述研究结果为进一步制定粉棒束孢防治方法,同时也为粉棒束孢作为生防菌的有效保存提供了参考。

小儿罕见真菌感染的临床报道

目的 探讨念珠菌病的新类型和新条件下小儿真菌感染的临床表现和致病菌。方法 回顾性收集1975～2005年的临床资料44例，进行体外毛发感染试验、电镜观察、动物试验，流式细胞（FCM）、随机括增多态性DNA（RAPD）以及DNA基因序列检测等。结果 ①累计发现44例婴儿头部念珠菌病，其中病期长者可感染头发。②粉末毕赤酵母可致婴儿皮肤感染。③一种罕见的林生地霉可致脓癣样地霉病。结论 我们发现的婴儿头部念珠菌病，慢性皮肤、黏膜念珠菌病伴皮肤粉末毕赤酵母感染和罕见的林生地霉引起儿童脓癣样地霉病，均为文献率先报道，对防治和降低念珠菌病和其他酵母样真菌感染患者的死亡率有一定意义。

冬虫夏草培殖中粉棒束孢病害动态变化规律

【目的】本文探索了高海拔地区冬虫夏草培殖过程中寄主蝙蝠蛾幼虫粉棒束孢病害在土壤中的动态变化规律。【方法】本研究以分离的粉棒束孢为研究对象,模拟野外自然条件和室内人工饲养条件下蝙蝠蛾幼虫感染粉棒束孢病原菌的情况,测定蝙蝠蛾幼虫僵虫体及其周围土壤中粉棒束孢的动态变化。【结果】在室内人工饲养环境下僵虫体上宿存量随着感染粉棒束孢孢子量先逐渐增加,巅峰可达到16.48×10^9个,随后缓慢下降,3个月后仍保持在109水平,致死率保持在80%以上,周围土壤中的粉棒束孢含量先增加后缓慢下降,但是时间比僵虫体延后,致死率保持在50%以上;野外自然僵虫体上粉棒束孢含量增速比室内饲养环境缓慢,孢子量也是先逐渐积累,巅峰仅室内人工饲养环境的一半,随后快速下降,3个月后衰减了约90%,致死率低至50%以下,周围土壤粉棒束孢的含量缓慢增加后快速下降,致病率降至20%左右。【结论】野外高海拔自然环境不利于粉棒束孢的宿存和传播,室内饲养环境为粉棒束孢的宿存和传播里提供了有利条件,这可能是室内培殖容易爆发粉棒束孢病害的原因之一。

不同虫花棒束孢菌株固体培养提取物抗氧化和抗菌活性初步测定

虫花棒束孢(Isaria farinosa)是一种常见的土栖昆虫病原真菌,在害虫生物防治方面有着广泛研究和应用,其对人体保健、药效和活性成分等方面也有一定的研究。为了揭示不同菌株之间的差异,选择7个来源不同的菌株,经形态和分子鉴定后,通过大米固体培养和乙酸乙酯提取,进行了抗氧化和抗菌活性测定。研究结果表明不同来源的虫花棒束孢菌株,经相同条件的培养和提取得到的产物在抗氧化和抗菌活性方面呈现明显的差异,以菌株2142表现最佳,在抗菌实验中尤其突出。菌株2142乙酸乙酯粗提物(200 mg/m L)对蜡样芽胞杆菌的抗菌活性达到与阳性对照氨苄西林钠(80μg/m L)相似的水平。该菌株具有较好的应用前景,有待进一步深入研究。利用虫花棒束孢菌株研发保健产品或医药产品具有很好的潜力,但其菌株来源需要十分关注;筛选对人体安全可靠,并有利于产品开发利用的优良菌株是一项非常重要的工作。

1株重寄生真菌粉棒束孢鉴定及系统发育分析

报道寄生于蛹虫草子座尖端的1种真菌(No.YHIFXS-I001),通过形态和ITS测序鉴定其为粉棒束孢。研究发现,该粉棒束孢菌株具有长锥形,基部膨大、尖端变细的两型分生孢子梗,长链以及单孢两型分生孢子连结方式,拓宽了对粉棒束孢寄生式样和显微特征的认识。另外,对该菌株开展ITS测序分析,通过与GenBank中粉棒束孢ITS序列的整理和比较,确定NCBI数据库中粉棒束孢9条ITS序列为错误鉴定,同时解析了粉棒束孢种内ITS序列较低的遗传丰富度(单倍型多样性Hd为0.590,核苷酸多样性P i为0.00378)。利用ITS对粉棒束孢及其近缘物种分子系统学分析,发现粉棒束孢与其它棒束孢物种形成多系关系,这一结果揭示了棒束孢属3系分支的系统分类格局,暗示粉棒束孢与其他棒束物种进化差异,对其系统学研究将有启示作用。

酵素菌中酵母菌的分离鉴定

目的 对分离自酵素菌的 11株酵母菌 (Yeast)进行分类鉴定。方法 通过实验观察酵母菌株的细胞形态、大小、结构 ,繁殖方式 :单极芽殖、二极芽殖、多边芽殖或裂殖。能否形成非结合子囊、结合子囊和子囊孢子。菌落类型 :光滑型、粗糙型或粘液型。菌落的大小形态、质地、颜色、透明度、气味。假菌丝生长试验 ,掷孢子试验。碳水化合物的发酵试验 ,碳源、氮源的同化试验。无维生素培养基生长试验 ,放线菌酮抗性试验 ,尿酶、卵磷、土温分解试验。重氮基蓝B试验 ,类淀粉化合物形成试验 ,5 0 %葡萄糖生长试验 ,10 %NaCl生长试验 ,37℃、40℃生长试验等项生理学和生物化学实验 ,对酵母菌的表型性状进行研究。结果 5株酵母菌鉴定为粉状毕赤酵母 ;6株酵母菌鉴定为酿酒酵母。结论 粉状毕赤酵母和酿酒酵母是构成酵素菌菌种的主要活性菌种。对分离自酵素菌的 11株酵母菌 (Yeast)进行分类鉴定。

小金蝠蛾幼虫血细胞对病原真菌的免疫防御研究

[目的]研究小金蝠蛾幼虫血细胞对不同病原菌侵染的细胞免疫响应差异,揭示拟棒束孢病害发生和冬虫夏草菌形成机理的细胞免疫差异。[方法]利用光学显微镜观察小金蝠蛾幼虫感染病原菌后血细胞的数量、形态变化、细胞免疫反应和黑化反应,以L-多巴为底物,采用分光光度法测定感染不同时间后的血淋巴中酚氧化酶活性。[结果]小金蝠蛾幼虫感染冬虫夏草菌的生存曲线无显著差异,血细胞对冬虫夏草菌无明显的集结、包囊、黑化等免疫作用,酚氧化酶活性侵染初期出现降低,然后逐渐恢复至健康幼虫水平;小金蝠蛾幼虫感染粉棒束孢的生存曲线具有显著差异,对感染早期血细胞具有明显的集结、包囊、黑化等免疫响应,酚氧化酶活性初期降低后逐渐升高。[结论]小金蝠蛾幼虫血细胞对病原真菌冬虫夏草菌和粉棒束孢免疫防御响应策略具有显著差异,血细胞对冬虫夏草菌无明显的免疫反应,对粉棒束孢虽然有强烈的免疫反应,但是不能阻止粉棒束孢的快速萌发而导致幼虫短期内死亡。

应用实时荧光PCR检测甜菜霜霉病菌

【目的】建立用于快速检测甜菜霜霉病菌Peronospora farinosa f.sp.betea Byford的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法。【方法】根据已报道的P.farinosa f.sp.Betea Byford及近似种28S r DNA序列同源性比对结果,设计用于检测甜菜霜霉病菌的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测引物。利用所建立的方法对包括P.farinosa f.sp.Betea在内的6种甜菜上的病原菌和5种其他霜霉病菌基因组DNA及12份甜菜种子样品进行检测,验证该方法的检测特异性、灵敏度及实用性。【结果】所建立的检测方法仅对甜菜霜霉病菌得到阳性扩增,其它参照菌株及阴性对照均无荧光信号扩增,准确排除了甜菜上其他5种病菌的干扰,其检测灵敏度显示最低限量为100 fg病菌DNA,应用该方法对不同来源的12份甜菜种子样品进行检测,田间监测结果一致。【结论】所建立的荧光检测方法能够对甜菜霜霉病菌进行快速筛查,为甜菜霜霉病菌的早期诊断和防控提供了一种技术手段。

粉棒束孢类枯草杆菌蛋白酶结构基因及其上游序列的克隆与分析

粉棒束孢是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛用于生物防治。运用PCR技术与DNA步移技术,从粉棒束孢中克隆出类枯草杆菌蛋白酶的结构基因及其上游序列。结构基因总长1 650 bp,扩出的结构基因DNA与其cDNA比较在距离起始密码子369 bp处有一个内含子,大小为51 bp。通过DNA步移技术得到的上游序列大小为3 189 bp,与cDNA相互重叠的部分为352 bp。分析表明,上游序列中没有明显的TATA-盒和CAAT-盒,但含有GC-box、热激转录因子(HSF)等重要的转录因子结合位点,以及GATA等启动子顺式调控元件。

卵寄生真菌虫草棒束孢几丁质酶基因IFCHI1的克隆与分析

为研究卵寄生真菌在寄生并破坏卵的过程中几丁质酶的作用,本研究从烟草南方根结线虫卵上分离得到虫草棒束孢HNE3,采用RT-PCR及RACE技术,首次克隆得到一个几丁质酶基因IFCHI1。该基因DNA序列全长1 417 bp,具有1个内含子,长度为61 bp,包含1个1 185 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由394个氨基酸组成的蛋白。通过在线软件分析,该蛋白理论分子量为44.1 k Da,等电点为4.88。通过Gen Bank比对,几丁质酶IFCHI1属于第18家族糖基水解酶,比对分析不同来源真菌几丁质酶,发现该几丁质酶具有典型的催化区保守序列SIGGW和FDGIDIDWE及结合区保守序列GTWEQGVYDY和GLGGAMWWESS。同源性比对发现,该几丁质酶同昆虫寄生真菌几丁质酶同源关系近。结果表明,从虫草棒束孢HNE3克隆得到几丁质酶基因IFCHI1,为进一步明确该菌产生的几丁质酶对南方根结线虫卵壳降解及降低孵化率的作用机理提供理论依据。

虫花菌菌丝体糖蛋白的分离、纯化及其性质研究

目的 研究虫花菌[Isaria farinosa(Dicks)Fri]菌丝体糖蛋白的分子性质和免疫活性。方法 糖蛋白经热水提取、离子交换柱层析、乙醇分级沉淀、DEAE Biogel A柱层析及SephadexG 50柱层析手段分离纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Sepharose6B柱层析证明其均一性。用柱层析法测定其分子量。用纸层析和气相层析分析确定其单糖组成。用红外光谱和核磁共振图谱推测其结构连接特性。动物实验研究其免疫活性。结果 分离得到一种糖蛋白PCAⅠ,为单一均匀的糖蛋白,分子量55.6万,糖含量74.2%,蛋白质含量25.6%。单糖组成为甘露糖和半乳糖,其摩尔比为1:1。糖链为高度分支的半乳甘露聚糖。PCAⅠ可明显提高小鼠单核巨噬细胞吞噬能力,并可使免疫器官脾脏明显增重。结论 PCAⅠ是虫花菌菌丝体的一种生物活性大分子成分。

基于双酶辅助双水相提取毕赤酵母酯化酶工艺优化及其酶学特性研究

以高产酯化酶毕赤酵母(Pichia farinosa)为研究对象,利用双水相萃取体系,在单因素试验基础上,选择聚乙二醇(PEG)分子质量、PEG质量分数、磷酸盐质量分数为主体因素,以比酶活力为指标进行结果分析,采用正交设计优化酯化酶提取工艺条件:在25mL 4%毕赤酵母细胞混悬液中添加1∶1(m/m)甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶双酶破壁剂,使其用量达1.2mg/g菌体,破壁温度为55℃,双水相体系中NaCl质量分数为1%,PEG分子质量为800,PEG质量分数为29%,磷酸盐质量分数为8%,在此条件下酯化酶比酶活力为3050U/g。酶学特性结果显示,该酯化酶最适反应温度35℃,最适pH 6.0时酯化酶酶活力最高,金属离子Zn^(2+)可提高酯化酶活性,Na^(+)影响较小,Mg^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)均有一定的抑制作用,且Cu2+抑制作用最明显。本研究对毕赤酵母功能微生物酯化酶在酿酒领域的开发应用具有重要的参考价值。

冬虫夏草人工培殖过程中寄主昆虫粉拟青霉病原菌的分子生物学研究

虫草棒束孢Isaria farinosa是冬虫夏草人工培殖过程中寄主昆虫粉拟青霉病的病原菌。该文通过统计分析国内外相关文献和NCBI网站上登录的相关序列和基因信息,分析虫草棒束孢的分子生物学研究进展。结果发现不同国家发表的文献不同,登录的相关序列或基因的种类和数量存在差异。我国发表的文献和登录的序列或基因总量都最多,美国登录的功能基因总量最多。相关文献主要涉及粉拟青霉病在生物防治方面的应用。而与分子生物学相关的研究主要集中在该菌的系统分类学上;近年来开始了与虫草棒束孢作为生防菌相关的蛋白酶基因和几丁质酶基因等的研究。随着冬虫夏草在健康领域影响力的增强,以及虫草棒束孢全基因组序列的测序完成和药理活性的不断揭示,对虫草棒束孢分子水平的研究也必将越来越广泛和深入。

聚六亚甲基双胍对蝙蝠蛾幼虫病原菌粉棒束孢的杀菌效果和毒性评价

为了解聚六亚甲基双胍对冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫病原菌粉棒束孢的杀菌消毒效果和对蝙蝠蛾幼虫的毒性,本文采用了悬液定量杀菌试验、现场试验、稳定性试验及昆虫毒性评价方法,对该消毒剂的消毒相关性能及安全性进行试验观察。结果显示含2g/L聚六亚甲基双胍消毒液对粉棒束孢孢子悬液或者现场试验作用45–60min,杀菌率均可达到99.00%以上。聚六亚甲基双胍消毒原液及稀释液37℃保存3个月与1个月的下降率分别为2.10%和3.20%,性质比较稳定、杀菌效率短期内无显著降低;含量≤10g/L聚六亚甲基双胍消毒液对蝙蝠蛾幼虫死亡影响不显著,无明显的不良反应,属于实际无毒类物质。聚六亚甲基双胍消毒液性质稳定、杀菌效果好、无毒,可用于蝙蝠蛾幼虫饲料、饲养盒等的消毒。

一株感染杨尺蠖蛹的病原真菌的分离及鉴定

【目的】从山西省洪洞县的杨树丰产林中采集到几头自然染菌的杨尺蠖Apocheima cinerarius越冬蛹虫尸,经分离纯化得到一株病原真菌,定名为YHT01,确定该菌株的分类地位。【方法】用该菌株孢子悬浮液(1.0×108 conidia/m L)感染杨尺蠖蛹进行回接杀虫实验,扫描电镜观察菌株形态学特征,ITS序列测定并构建系统发育树对YHT01菌株进行分子鉴定。【结果】经YHT01菌株感染之后,杨尺蠖蛹节间处长出白色菌丝。该菌株在PDA培养基上的菌落呈椭圆形,白色,绒毛状,菌落背面呈橙黄色;扫描电镜观察结果显示,该菌株孢梗束呈扫帚状,分生孢子小,卵形至椭圆形,壁光滑,大小为(2.1-3.4)μm×(1.1-1.8)μm。该菌株的r DNA-ITS序列与Gen Bank中粉棒束孢Isaria farinosa(Holm:Fr.)Fr.(AB233337)的序列相似性达99%,在系统发育树的同一分支上。【结论】YHT01是杨尺蠖蛹的一株病原真菌,粉棒束孢Isaria farinosa。